实验48 植物组织中几种酶的组化定位鉴定

实验48 植物组织中几种酶的组化定位鉴定

原理

　　在植物生理学的研究中，可利用组织化学的方法，来说明植物体内的生理活动问题。例如，当需要检定某种物质性质和在植物体内分布时，用组织化学的方法，可以达到定位和定性的目的，而且有时比用剥离的官或组织，作生化测定更能说明问题。植物组织中酶的组化鉴定的基本原理，是以某物质为底物在专一酶作用下，产生一种有颜色的化合物来表明有某种酶的存在。

　　细胞色素氧化酶：利用擾Nadi斣恚远园被谆桨泛挺痢涟肺剩赴匮趸傅淖饔茫胚岱永侗硎久傅拇嬖冢从κ饺缦拢篲

　　过氧化物酶：在过氧化氢存在下，联苯胺经酶作用脱氢而生成蓝色的络合物，反应式如下：

　　多酚氧化酶：邻苯二酚或邻苯三酚在多酚氧化酶的作用下，产生茶褐色化合物或棕色络合物，反应式如下：

　　三磷酸腺苷酶：三磷酸腺苷(ATP)经酶作用分解为二磷酸腺苷(ADP)，并释放出无机磷酸，与铅离子结合产生磷酸铅，遇硫则生成硫化铅黑色沉淀，可用下列简式表示：

　

　　脱氢酶：在脱氢酶作用下，氯化三苯基四氮唑(TTC)被还原为三苯基甲(TTF)，溶液从无色变成红色，反应式如下：

　　本实验学习用于检定植物组织中的细胞色素氧化酶，过氧化物酶，多酚氧化酶，三磷酸腺苷酶以及脱氢酶的技术。

仪器药品

　　冰冻切片机 　　　　　　　　　显微镜

　　天平 　　　　　　　　　　　　天筒

　　单面刀片 　　　　　　　　　　尖头镊

　　培养皿　　　　　　　　　　　 指管

　　1．1%α－萘酚溶液：称取1gα－蔡酚溶于100ml蒸馏水中，加热煮沸，然后逐滴加入25%KOH，直至蔡酚完全溶解为止，过滤后保存于冷暗处。

　　2．1%对氨基二甲基苯胺溶液：称取1g对氨基二甲基苯胺盐酸，放入100ml蒸馏水中加热煮沸，然后保存在冰箱中，只能保存一星期。

　　3．0.1mol/L磷酸缓冲液，pH5.8（见附表2）。

　　4．0.1%钼酸铵溶液：称取0.1g钼酸铵溶于100ml蒸馏水中。

　　5．0.1%联苯胺溶液：称取0.1g联苯胺于100ml蒸馏水中，加热煮沸溶解，冷却后加入30%过氧化氢1滴，此溶液只能保存一星期。联苯胺对人有毒，应避免接触皮肤或呼吸道吸入。

　　6．0.1mol/L磷酸缓冲液，pH7.2（见附表2）。

　　7．1%邻苯二酚溶液：称取1g邻苯二酚溶于100ml蒸馏水中，低温暗处保存1─2星期。

　　8．三磷酸腺苷溶液：称取125mg三磷酸腺苷钠盐，溶于100ml蒸馏水中，低温保存。

　　9．0.2mol/L Tris─HCl缓冲液，pH7.2（见附表2）。

　　10．2%硝酸铅溶液。

　　11．1%硫化铵溶液。

　　12．0.1%2，3，5－氯化三苯基四氮唑溶液。

　　13．0.1mol/L硫酸镁溶液：2.46g MgSO₄ ·7H₂ O溶于蒸馏水中使成100ml。

实验步骤

　　1．样品处理

　　 将培养的实验材料放入盛有冰块的容器内，然后放在冰冻切片机的冰冻头上，按横向（纵向）切成10─15μm的薄片（如果没有冰冻切片机，可用废照相胶片夹持植物样品，并在盛有冰块的大瓷盆上进行徒手切片，保持样品的温度可以达到5℃左右）。薄片切得后立即放入置于冰中的重蒸馏水内，待所需片子切制完毕后，分别按下面操作程序加以处理。每一试验必须同时作对照。试验和对照片子是材料上紧相邻的部分，也就是说切一片作试验处理时，挨着的下一片就作为对照，这样才能表明这两张切片的生理状况原来是一致的。

　　2．几种酶的定位鉴定

　　(1)细胞色素氧化酶：将切得的新鲜切片放入pH5.8的磷酸缓冲液内，在室温下（约25℃）放置5─10分钟，然后用干净而又很细的玻棒，将切片移入1%α－萘酚和1%对氨基二甲基苯胺的等量混合液中，约5分钟后，取出放在玻片上加重蒸馏水1滴，盖上盖玻片即可以在显微镜下观察。对照片子从磷酸缓冲液中取出后，即放入重蒸馏水中煮沸5分钟，然后放入底物混合液中进行反应，而后按上述步骤进行观察比较。

　　(2)过氧化物酶

　　 ①将切片放入pH7.2磷酸缓冲液中，在2─5℃下浸5分钟。

　　 ②将切片移于0.1%钼酸溶液中，在室温下处理5分钟。

　　 ③将片子移入0.1%联苯胺溶液中，处理1/2─1分钟，取出放在玻片上加蒸馏水1滴，盖上盖玻片，在显微镜下观察。

　　 对照片子煮沸10─15分钟，杀死组织后，按上述步骤作同样处理后观察。

　　(3)多酚氧化酶

　　 ①新鲜组织的切片立即投入pH7.2磷酸缓冲液中，在2─5℃下放置5分钟。

　　 ②将切片移至1%邻苯二酚溶液中，在37℃保温10小时左右，取出观察。

　　对照片子经煮沸杀死组织后，再按上述步骤作同样处理，然后进行观察比较。

　　(4)三磷酸腺苷酶

　　①底物混合液的配制：取20ml ATP溶液，20ml Tris—HCl缓冲液(pH7.2)，3ml硝酸铅溶液，5ml硫酸镁溶液，2ml蒸馏水，用时将上述溶液依次混合，取用上清液，用后废弃。

　　②将切片投入上述底物混合液中，37℃保温1─3小时。

　　③用蒸馏水洗涤。

　　④在1%硫化铵中显色1分钟。

　　⑤再用蒸馏水洗涤后观察。对照片子先行煮沸杀死组织，然后再作同样处理。

　　(5)脱氢酶：将切片浸在氯化三苯基四氮唑溶液中，15分钟左右，有红色反应的部位，表明有脱氢酶的存在。

　　对照片子先行煮沸杀死组织，然后再作同样处理。