逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR

互联网2013-11-14

1168

逆转录- 聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction ，RT-PCR) 的原理是：提取组织或细胞中的总RNA ，以其中的mRNA 作为模板，采用Oligo （dT ）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA 。再以cDNA 为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR 使RNA 检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA 样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA 探针、构建RNA 高效转录系统。
一、反转录酶的选择
1 ． Money 鼠白血病病毒（MMLV ）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA 酶H 活性相对较弱。最适作用温度为<chmetcnv>37 ℃</chmetcnv> 。
2 ． 禽成髓细胞瘤病毒（AMV ）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA 酶H 活性。最适作用温度为<chmetcnv>42 ℃</chmetcnv> 。
3 ．Thermus thermophilus 、Thermus flavus 等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn² 存在下，允许高温反转录RNA ，以消除RNA 模板的二级结构。
4 ．MMLV 反转录酶的RNase H^- 突变体：商品名为SuperScript 和SuperScript Ⅱ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA 转换成cDNA ，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA 模板合成较长cDNA 。
二、合成cDNA 引物的选择
1 ． 随机六聚体引物：当特定mRNA 由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA 。用此种方法时，体系中所有RNA 分子全部充当了cDNA 第一链模板，PCR 引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA 中96% 来源于rRNA 。
2 ． Oligo(dT) ：是一种对mRNA 特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA 具有<chmetcnv>3 ’ </chmetcnv> 端Poly(A ) 尾，此引物与其配对，仅mRNA 可被转录。由于Poly(A )RNA 仅占总RNA 的1-4% ，故此种引物合成的cDNA 比随机六聚体作为引物和得到的cDNA 在数量和复杂性方面均要小。
3 ． 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA 的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR 反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA <chmetcnv>3’ </chmetcnv> 端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA ，导致更为特异的PCR 扩增。
二、 试剂准备
1 ．RMA 提取试剂
2 ．第一链cDNA 合成试剂盒
3 ．dNTPmix ：含dATP 、dCTP 、dGTP 、dTTP 各<chmetcnv>2mM </chmetcnv>
4 ．Taq DNA 聚合酶
三、操作步骤
1. 总RNA 的提取：见相关内容。
2. cDNA 第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA 第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL 公司提供的SuperScript^TM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
（1 ）在0.5ml 微量离心管中，加入总RNA 1-5 μg ，补充适量的DEPC H₂ O 使总体积达11 μl 。在管中加10 μM Oligo （dT ）_12-18 1 μl ，轻轻混匀、离心。
（2 ）<chmetcnv>70 ℃</chmetcnv> 加热10min ，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min 。
然后加入下列试剂的混合物：
10 × PCR buffer 2 μ l
<chmetcnv>25mM</chmetcnv> MgCl₂ 2 μ l
<chmetcnv>10mM</chmetcnv> dNTPmix 1 μ l
<chmetcnv>0.1M</chmetcnv> DTT 2 μ l
轻轻混匀，离心。<chmetcnv>42 ℃</chmetcnv> 孵育2-5min 。
（3 ）加入Superscript Ⅱ1 μl ，在<chmetcnv>42 ℃</chmetcnv> 水浴中孵育50min 。
（4 ）于<chmetcnv>70 ℃</chmetcnv> 加热15min 以终止反应。
（5 ）将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，<chmetcnv>37 ℃</chmetcnv> 孵育20min ，降解残留的RNA 。<chmetcnv>-20 ℃</chmetcnv> 保存备用。
3 ．PCR ：
（1 ）取0.5ml PCR 管，依次加入下列试剂：
第一链cDNA 2 μ l
上游引物（10pM ） 2 μ l
下游引物（10pM ） 2 μ l
dNTP(<chmetcnv>2mM</chmetcnv> ) 4 μ l
10 × PCR buffer 5 μ l
Taq 酶（2u/ μl ） 1 μ l
（２） 加入适量的ddH₂ O ，使总体积达50 μl 。轻轻混匀，离心。
（３） 设定PCR 程序。在适当的温度参数下扩增28-32 个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR 扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD ）的特异性引物，同时扩增内参DNA ，作为对照。
（４） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
（５） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
四、注意事项
1 ． 在实验过程中要防止RNA 的降解，保持RNA 的完整性。在总RNA 的提取过程中，注意避免mRNA 的断裂。
2 ． 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3 ． 内参的设定：主要为了用于靶RNA 的定量。常用的内参有G3PD （甘油醛-3- 磷酸脱氢酶）、β-Actin （β- 肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA 定量误差、加样误差以及各PCR 反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4 ． PCR 不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA 起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5 ． 防止DNA 的污染：
（１） 采用DNA 酶处理RNA 样品。
（２） 在可能的情况下，将PCR 引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA 的共线性