测定核酸的方法

<font>琼脂糖凝胶电泳法<br /> 琼脂糖凝胶具有较大的孔径，因而适用于对较大分子的电泳分离，目前琼脂糖电泳凝胶法已成为核糖核酸和脱氧核糖核酸检测、分离和性质研究的标准手段。<br /> 核酸在琼脂糖凝胶中的电泳迁移率取决于琼脂糖浓度、核酸分子的大小以及核酸分子的形状三个因素。一般来说，较低浓度的琼脂糖凝胶适合于较大分子物质的电泳分离，其电泳速度与分子量大小有关，且分子量的对数值与电泳迁移率之间存在着线性关系，由此可以作为定量的基础。其操作方法如下：<br /> 1 仪器装置<br /> 电泳室及直流电源。常用的水平式电泳室即可，电源为稳压直流电源，常压电泳一般在100-500V，高压电泳一般在500-10000V。<br /> 2 试剂<br /> （1） 醋酸-锂盐缓冲液（pH3.0） 取冰醋酸50ml，加水800ml混合后，用氢氧化锂调节到pH值至3.0，在加水至1000ml。<br /> （2） 甲苯胺蓝溶液 去甲苯胺蓝0.1g，加水100ml使溶解。<br /> 3 操作法<br /> （1） 制胶 取琼脂糖约0.2g，加水10ml，置水浴中使溶胀完全，加温热的醋酸-锂盐缓冲溶液（pH3.0）10ml，混匀，趁热将胶液涂布于大小适宜（2.5cm×7.5cm或4cm×9cm）的玻板上，厚度约3mm，静置，待凝胶结成无气泡的均匀薄层，即得。<br /> （2） 标准品溶液及供试品溶液的制备 按照各药品项下制备。<br /> （3） 点样与电泳 在电泳槽内加入醋酸-锂盐缓冲溶液（pH3.0），将凝胶板置于电泳槽架上，经滤纸桥浸入缓冲液。于凝胶板负极端分别点样1μl，立即接通电源，在电压梯度约30V/cm、电流强度1-2mA/cm的条件下，电泳约20min，关闭电源。<br /> （4） 染色与脱色 取下凝胶板，用甲苯胺蓝溶液染色，用水洗去多余的染色液至背景无色为止。<br /> 在凝胶电泳中，首先应用的是琼脂电泳，它具有以下优点。1琼脂含液体量大，可达98%-99%，近似自由电泳，但是样品扩散度比自由电泳小，对蛋白质吸附极微。2琼脂作为支持体有均匀，区带整齐，分辨率高，重复性好等优点。3电泳速率快。4透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外检测仪做定量测定。5区带易染色，样品易回收，有利于制备。然而琼脂中有很多硫酸根，电渗作用大。琼脂糖是从琼脂中提取出来的，是有半乳糖和3,6-脱水-L-半乳糖相互结合的链状多糖。含硫酸根比琼脂少，因而分离效果明显提高。</font>