测定细胞MDA的方法

【求助】关于测定细胞MDA的方法

参与者：m05yuwei

各位战友：

大家好！我想做细胞的MDA，不知用什么方法好。用比色方法一个样本需要多少细胞？细胞太少是不是测不出？有人说要达到一定数量才行。具体步骤可否详告？

参与者：m05yuwei

没人帮个忙吗？

参与者：无影无踪

MDA是丙二醛吗？如果是的就比较容易了

参与者：无影无踪

细胞内的检测需要经过适当的处理，即制成约10%的匀浆液，放置-20℃冰箱内，反复冰融3次，然后用显微镜观察细胞是否完全破碎，如不完全则继续冻融2次，再以4000转/分，离心15分钟，匀浆上清液作SOD、MDA测定。而细胞上清则无须这些步骤，直接检测即可。

细胞测MDA有以下建议，希望有帮助

1.细胞的量要大，用75 cm 2 的大瓶比较好。细胞量少了最后比色时值可能和空白一样。

2.-20度反复冻融三次和超声效果差不多，但用超声速度快一点。每次冻融时用漩涡振荡仪把它混匀；超声时要注意时间，不要过热。

3.尽量不要用南京建成的试剂盒，效果不理想。TBA法很成熟，我们都是自己配的，效果很好。

4.一定要做空白对照，最好做阳性对照。

5.煮沸时，在离心管上用针戳个洞，以免液体喷出。

具体步骤可在丁香园上查查，应该是有很多人做的

参与者：yusi100

南京建成的不好？我才买的，还没用过，岂不是~~~~

参与者：m05yuwei

谢谢高人指教！只是我做的不是培养的细胞，而是从人体中采出的新鲜细胞标本，我想等全部标本收集完之后（大概3个月）之后再一起做，所以很想知道能否将标本处理后保存一段时间再检测，标本怎么处理？怎么保存？我也查了很多资料，大都是做培养细胞内MDA，这方面的资料没查到，真的希望得到高人指教！不胜感激！

参与者：m05yuwei

另南京建成的不好，可否推荐一家较好的公司呢？

参与者：m05yuwei

75 cm 2 的大瓶大概有多少细胞？106？没做过细胞培养，不知道啊！

参与者：无影无踪

我也算不上什么高手

是10的6次方个细胞，可以先初步的进行细胞计数，可以用血细胞计数板，方法很简单的，然后根据需要调整细胞数量就可以了

参与者：无影无踪

细胞计数：

1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

一般还要进行细胞活力的检察，常用的是台盼蓝法，活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；

方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；

2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力； 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

参与者：无影无踪

细胞计数：

1、将血球计数板及盖片擦拭干净，并将盖片盖在计数板上。

2、将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。

3、静置3分钟。

4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/ 4×10000

注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。

一般还要进行细胞活力的检察，常用的是台盼蓝法，活细胞不被染色，死细胞染成蓝色；用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力；

方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中；

2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟；

3、吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片；

4、镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数，计细胞活力； 死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞，活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。

活力测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液对原细胞悬液的加倍稀释作用。

参与者：无影无踪

南京的不好也是相对的，你如果发国内的文章的话估计也可以，如果经费够的话还是买国外的好一些（有钱就什么都好办了）

另外，m05yuwei问的细胞保存的方法，主要用液氮保存，理论上是可以无限期保存，但是，你说你是取人体活细胞做的，要保存三个月，这就有一个问题，你是测的氧化应激的指标本身就与细胞的代谢状态相关，液氮保存是否会对结果有影响？？？？？？所以还是建议你取了细胞就马上做，这样得出来的结果也可信一些，当然，这只是个人观点，如果你查到文章说你那样做可行的也可以试一试。

参与者：m05yuwei

嗯，知道了，谢谢无影无踪。假如把细胞裂解后离心，取上清冻存，是不是就可以了？文献上有将卵泡液离心后取上清冻存－70度再检测氧化应激的。我要是每天都取标本做的话，是不是批间差异就很大。呵呵，还要继续查。

参与者：m05yuwei

嗯，知道了，谢谢无影无踪。假如把细胞裂解后离心，取上清冻存，是不是就可以了？文献上有将卵泡液离心后取上清冻存－70度再检测氧化应激的。我要是每天都取标本做的话，是不是批间差异就很大。呵呵，还要继续查。

另还想问测定细胞活力的目的和意义是什么?是测定氧化应激中的必要步骤还是和氧化应激结合就更能表现细胞的状态？

参与者：无影无踪

这主要是细胞培养方面的知识，一般细胞培养都需要做的

其实仔细思考一下，你最好也要保证每次检测的细胞数目大致相等，否则结果就不是很可信了