RNA酶保护试验((RNase Protection Assay,RPA)方法
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一、试剂准备
1. GACU POOL:取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl,加DEPC H2O至100μl。
2. 杂交缓冲液 IPES 0.134g、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml,加DEPC H2O至10ml。
3. RNase消化液:5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA(pH8.0)20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl,加DEPC H2O至2ml
二、操作步骤
1.反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备,也可以用含启动子的PCR产物为模板制备,本文介绍后者。
(1)设计含T7启动子的PCR引物
由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板,所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列:
T7启动子序列为:5’-TAATACGACTCACTATAGGG
引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度,具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR,即先扩增出一较长的片段,再以该片段为模板扩增出较短的片段,以保证探针的特异性,如下图所示:
上游引物
下游引物Ⅱ T7 启动子序列
下游引物Ⅰ
(2)PCR
先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR,再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。
(3)探针合成标记与纯化
在0.5ml 离心管中加入下列试剂:
RNasin (40U/μl) 0.5μl
GACU POOL GAC
(含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM) 2μl
[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl
DTT (二硫苏糖醇,0.1M) 1μl
5×转录 buffer 2μl
模板(50ng/μl) 1μl
T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl
混合后,短暂离心,37OC保温1hr。
加入DNaseⅠ(10U/μl)1μl, 37OC 15min, 然后75 OC 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。
加入:饱和酚 50μl
氯仿 50μl
酵母tRNA(2μg/μl) 4μl
DEPC H2O 100μl
室温下充分混匀,离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中,加入100μl氯仿,混匀,离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中,再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl,混匀后,-20OC静置30min。4OC离心13500g×10min。弃上清液,沉淀用75%乙醇100μl洗涤,4OC离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀,4OC下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。(参见本节电泳步骤)。
2.杂交
(1) RNA提取后溶解在杂交缓冲液中,浓度为1μg/μl。
(2)取8μl RNA加入1-3μl探针(根据探针检测结果调整)于0.5ml 离心管中。
(2) 80OC保温2min,然后40-45OC下杂交12-18hr。
3. 消化
(1) 杂交管于37 OC保温15min,加入RNase消化液,37 OC保温30min。
(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl,混匀,37 OC保温10min。
(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿,混匀,室温离心,10000g×2min。
(4) 转移上层液到另一0.5离心管中,加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl,再加入200μl异丙醇,混匀后,置-20OC 30min,4 OC离心,135000g×10min。
(5) 弃上清液,室温下挥发乙醇,加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。
4、电泳与放射自显影
(1)配制凝胶:(50ml)
40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺(19:1) 6.25ml
5×TBE 10ml
尿素 24g
加H2O至50ml
溶解后加入25%过硫酸胺50μl,TEMED 50μl,混匀,注入电泳槽中,插入梳,待胶凝固。
(2)预电泳
以1×TBE为上下槽电泳缓冲液,加上电压后进行预电泳,如果用测序电泳装置,电压应达2000v以上,功率设定为100w,温度设为50 OC。待胶板温度达50 OC时,暂停电泳,准备加样。
(3)加样
将已溶解在加样缓冲液中的样品80 OC加热2min,立即加样到胶孔中,电泳1-2hr。(电泳条件同预电泳)。
(3) 电泳结束后,打开胶板,用滤纸取下胶,覆上一层保鲜膜,放置于暗盒中,暗室红光下,压上一张X片,盖上暗盒,-70OC曝光1-3天。暴光结束后,将X光片显影、定影、水洗、晾干。