Northern杂交试验指导手册－为制备RNA探针模板的DNA片断亚克隆

A． 载体选择

为了获得能够在体外转录RNA探针的DNA模板，其克隆载体必须带有可供选择的特异转录启动子，同时，为了获得理想的Northern杂交试验结果，载体选择带有两种不同类型而方向相反启动子的载体，以便在RNA探针制备时同时得到两条链的转录探针。
常用的这类载体有：pGEM-3/pGEM-4 ( 2.87kb, SP6/T7 ).
pGEM-3Z ( 2.74kb, T7/SP6 ).
PGEM-3Zf(-) (3.2kb, T7/SP6 ).
Bluescript M13- (2.96kb, T7/T3 ).
按照试验的经济有效原则，本试验选用 Bluescript M13-。



B. 目的DNA序列与载体连接

从所建立的cDNA文库中挑选出带有目的DNA片断的克隆，扩增后提取质粒，采用限制性内切酶处理或采用PCR特异扩增的方法分离出目的DNA片断；采用标准质粒提取方法提取载体质粒（见黄健试验）。然后按下列程序进行连接。

试剂及其制备

T4 DNA连接酶
连接缓冲液（可直接购买或配制），10X 缓冲液配方为：
0.5 mol/L Tris-HCl pH 7.8
0.1 mol/L MgCl2
50mmol/L 二硫苏糖醇（DTT）
ATP 5mmol/L ( 如果直接购买商品缓冲液，有的已加在缓冲液中，但有些需单独加入)。
BSA 0.25mg/L
PEG (3500~8000均可，在缓冲液中加入2%~3% 的PEG可提高平端连接效率)。
无菌蒸馏水（SDW）



试验程序

1． 建立以下反应体系（终体积20μl）：
4μl 质粒 ( 50μg/μl)
6μl 目的DNA ( 100μg/μl)
2μl 10X 连接缓冲液
2μl DNA 连接酶
6μl 无菌蒸馏水
2． 反应管置于15℃条件下保温反应24小时，65℃加热10min.终止反应。
3．取5～10μl连接反应物用微型凝胶电泳检测连接效果，其余反应物于-20℃保存备用。

注意事项

1．保证连接反应中目的DNA与质粒载体的浓度比例在3∶1，因为高浓度的DNA有利于片断与载体的连接，低浓度的DNA则会增加载体自连。
2．DNA连接酶对温度敏感，在15℃以上会迅速失活，因此，连接反应的温度控制必须严格。
3．为了保证RNA探针的质量，模板DNA片断的完整性和纯度十分重要，在DNA制备时要严格控制。

C．感受态细胞制备（CaCl2法）

试剂及其配制

LB培养基（200ml）：2g胰蛋白冻、1g酵母浸膏、2g NaCl，溶解后调整pH至7～8，定溶到200ml混匀，分装成50ml/瓶后灭菌4℃保存。
CaCl2 0.1mol/L，4℃保存。
E. coli菌株：JM105或TG1。

试验程序

1．将单菌落菌株接种于5ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养过夜。
2．取0.5ml过夜培养的菌液接种于50ml LB培养基中，在37℃条件下振荡培养约3小时，用分光光度计检测OD600＝0.3～0.4时，取出培养瓶置于冰上完全冷却。
3．将菌液转入离心管中，在4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。
4．将沉淀悬浮于预冷的25ml 0.1mol CaCl2中，在冰上放置30min.后，于4℃条件下，3500rpm离心5～10min.，弃去上清液。
5．沉淀重悬于2ml 预冷0.1mol CaCl2溶液中，菌液直接用于转化。或加入1.6ml 80%甘油，按每管200μl分装于2ml的冻存管中，于液氮中速冻后-70℃保存备用。



D. 质粒DNA转化

试剂及其配制

LB培养基（同C）。
氨苄青霉素：用无菌蒸馏水配制成50mg/ml的贮存液。
含氨苄青霉素（AP）的LB平板：每升LB培养基中加入15g琼脂，溶化后高压灭菌，待稍凉后再加入氨苄青霉素至终浓度为50~100μg/ml。在超净工作台上用9cm灭菌培养皿铺板。
IPTG（isopropylthio-β-D-galactoside 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：取2g溶于8ml双蒸水中，定容至10ml，过滤灭菌后-20℃保存。
X � Gal ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)：贮存液浓度为20mg/ml，溶于二甲基甲酰胺中，-20℃黑暗保存。

试验程序

1．取制备分装好的感受态细胞，置于冰上5min.，加入连接产物10μl，轻轻混匀后置于冰上30min.。
2．然后置于42℃水浴中热击细胞50s.，再置于冰上2min.。
3．向各管中加入200μl在37℃下预热的LB培养基，37℃下振荡培养1小时。
4．与此同时，将LB平板置于37℃下片刻，每板加入44μl IPTG/X-Gal (4μl IPTG和40μl X-Gal )均匀涂布于平板表面放置约10min.使其吸附渗透。
5．将步骤3中培养的菌液涂布在制好的平板上，吹干后（在超净工作台中放置片刻）置于37℃下培养过夜。含有插入片断的菌落为白色。

E. 转化质粒的快速检测

试剂及其配制

煮沸缓冲液：蔗糖 8％
Triton X-100 1.5%
EDTA(pH 8.0) 50mmol/L
Tris-HCl(pH 8.0) 10mmol/L
LB培养基（同C）
氨苄青霉素（AP）（同D）

试验程序

1．选取白色单菌落，接种到3ml含AP的LB液体培养基中，37℃下振荡培养过夜。
2．将培养物等分成2份按菌落编号，每一菌落编号切勿出错。一份于4℃下保存备用，每一菌落编号切勿出错。另一份转入Eppendorf中，7000rmp离心2min.，弃去上清液，吸干残留液体。
3．将沉淀菌体细胞悬浮于350μl煮沸缓冲液中，加入25μl溶菌酶后，涡旋混合。
4．将管置于100℃沸水中煮40s.，取出立即在12000rmp条件下离心15min.。
5．取10μl上清液，加入溴酚蓝染料后，在0.8%琼脂糖胶上电泳。
6．在紫外灯下根据分子量检测插入片断的完整性。

如果不能确定转化片断的大小，则要进一步杂交、测序分析。选取经检测含有完整目的DNA片断的菌落，转接于2ml TB培养基（每升16g胰化蛋白冻/10g酵母提取物/5g氯化钠）中，37℃下振荡培养过夜，取850μl菌液加入到一2ml的冻存管中，再加入150μl 50%的甘油，混匀后置于液氮中快速冷冻，再置于-70℃条件下保存。