我作NORTHERN的心得

互联网2013-09-06

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我们试验室作NORTHERN的一些总结，欢迎指正，谢谢。 Northern杂交 准备物品：50ml量筒1个 100ml量筒1个 300ml烧杯1个 250ml 烧杯1个 250ml的锥形瓶1个 10ml 离心管2个大小盘各1个镊子1把剪刀1把 DEPC水500ml 2，瓶玻璃棒1根电泳槽、转膜槽、梳子、杂交桶以上物品均用DCPE水处理 一、试剂 1. 4 M LiCl (50ml) LiCl 8.478g定量至50ml，DEPC处理，灭菌。 2. 1 M Na3PO4 (50ml) 19.01g定量至50ml，DEPC处理，灭菌。 （注：该溶液配完后，可以溶解并消毒，但是不要放在4℃，其溶解性不好，放在室温下仍有小结晶。） 3. 10% SDS (100ml) SDS 10g加入100ml DEPC水。 （注：含有SDS消毒容易喷出瓶塞，应用牛皮纸包扎紧） 4. 10% N-lauroylsarcosine (10ml) 0.2―0.45 um膜过滤。 5. BufferⅠ：Maleic acid buffer (500ml) 1× 用NaOH调pH为7.5，DEPC处理。 （注：调节PH时，需要的碱较多，可以直接加入固体粉末约2克。） 0.1M maleic acid 5.8g 0.15M NaCl 4.4g 6. BufferⅡ：Blocking solution 1% (100ml) Blocking Reagent 1g，加入100ml maleic acid buffer，60℃溶解1小时，加入100ul DEPC处理，灭菌。 7. 洗液Ⅰ （500ml） 2×SSC，0.1%SDS DEPC处理使用量：50ml/100cm2 20×SSC 50ml + 10% SDS 5ml + 水445ml （注：含有SDS消毒容易喷出瓶塞，应用牛皮纸包扎紧） 8. 洗液Ⅱ （500ml） 0.1×SSC，0.1%SDS DEPC处理 20×SSC 2.5ml + 10% SDS 5ml + 水497.5ml （注：含有SDS消毒容易喷出瓶塞，应用牛皮纸包扎紧） 9. Washing Buffer (300ml): Maleic acid buffer + 0.3% Tween 20 (v/v) 10. Detection buffer (200ml) DEPC处理）PH9.5 0.1M Tris-HCl 2.42g 0.1M NaCl 5M NaCl 4ml 50mM MgCl2 2.03g 11. High SDS hybridization buffer (50ml)，混匀，水浴或65℃烤箱1小时，置-20℃保存。 （注：使用时新鲜配置） DEPC处理水 9ml SDS 7% 3.5g Formamide, deionized, 50% 25ml 20×SSC 12.5ml 1M sodium phosphate, pH 7.0 2.5ml N-lauroylsarcosine, 0.1% (w/v) 0.5ml blocking reagent, 2% 1g 12.1000ml 0． 01N的NaOH 0.4g 3M的NaCl 175.32g 13. 20×SSC (500ml) DEPC处理 3M NaCl 87.66g 0.3M sodium citrate 44.12g 用10M NaOH调pH7.0 14. 10×MOPS电泳缓冲液：小烧杯中MOPS 4.19g，加入DEPC水，3M乙酸钠2.67ml，用10M NaOH调pH7.0，加入0.5M EDTA 2ml，用DEPC水定量至100ml，过滤除菌，倒入棕色瓶中，4℃保存。 15. 1M Tris-HCL （200 ml） 称取Tris碱24.22g，加纯水溶解，用浓盐酸调pH8.0，定量至200ml，加入DEPC 200ul，过夜，消毒。 16. 0.5M Tris-HCl (pH7.4) / 1.5M NaCl 称取Tris碱15.2g，加水约200ml。用浓盐酸调pH7.4，再加入NaCl 43.83g，定量至250ml，高压消毒。 17. loading buffer : 1ml, pH8.0 甘油（50%） 0.5ml EDTA(1mM) 0.5M EDTA 2ul 0.25%溴酚蓝 0.0025g 0.25%二甲苯青FF 0.0025g DEPC水 0.48ml 18. 3mol/l乙酸钠 100ml：乙酸钠40.8g，加入水溶解，10M NaOH调pH8.0，DEPC处理。 19. 0.5M EDTA 50ml：EDTA 9.31g，加入水溶解，10M NaOH调pH8.0，DEPC处理。 二、地高辛试剂盒标记cDNA探针（Cat No. 1093657） 1．DNA模板（0.5-3ug）15ul，沸水加热10分钟变性，迅速置冰浴中； 2．在冰上加入： 管5 hexanueleotide mix 2ul ―六聚体引物混合物 管6 dNTP mixture 2ul―dNTP 混合物 管7 Klenow enzyme 1ul 聚合酶 3．混匀，短暂离心，37℃水浴20小时（至少60min）； 4．加入0.5M EDTA 2ul (pH8.0)，终止反应； 5．沉淀：加入4 M LiCl 2.5ul和预冷100%乙醇75ul，混匀，-70℃ 30分钟或-20℃ 2小时。目的沉淀DNA探针 6．离心12000r, 15min，倒掉，再加入预冷70％乙醇50ul，离心数分钟，倒掉； 7．空气干燥，加入TE-buffer 50ul （注：在挥发乙醇时，不能太干，防止DNA不溶解） 三、实验操作 1、甲醛-琼脂糖电泳 1） 36ml水溶解0.75g琼脂糖，水浴至60℃，加入5ml 10×MOPS电泳缓冲液及12.3M甲醛(37%) 9ml（注：溶解在用微波炉溶解琼脂糖，尽量防止水分挥发，可以使用底火1.5分钟） 2）铺制凝胶，拨去梳子，放入电泳池，加入1×MOPS，约400ml，电泳缓冲液使其淹没凝胶1mm左右； （注：凝胶凝固较慢，应该放在4℃，约需要1小时，拔起梳子时，应该垂直、快速拔起，防止粘连，使底部暴露。） 3）在一EP管中加入以下物品，混匀，短暂离心，55℃保温15分钟；然后放在冰上加样，以消除RNA的二级结构。 RNA样品 11ul 10×MOPS电泳缓冲液 5ul 12.3M甲醛 9ul 甲酰胺 25ul 4）加入5ul加样缓冲液，总体积55ul，混匀，在5v/cm电压下（80mv）电泳至溴酚蓝泳动了凝胶长度的2/3；约需要1.5-2小时。点样时应该避免点在边上的孔中，不利于转膜时覆盖橡胶膜。（注：剪膜大小约10x9cm，此时应该把用DEPC水把尼龙膜自然浸湿，约需要3h） 5）取出凝胶，用0.01N的 NaOH和3M NaCl洗涤15min×2次； 6）用真空转移器把RNA从胶上转移至膜上，以0.01N的 NaOH和3M NaCl为转移缓冲液。 10cmHg，3 hr； （注：连好真空泵后应该实验一下，然后在放置凝胶，凝胶比较软，应该果断的把凝胶取出，并且反转一下，利于转膜，不能有气泡，应该用玻璃棒轻轻赶出，液面始终高于凝胶才有效，避免加样孔接触尼龙膜边缘，不利于抽真空，把凝胶取出后应该用含有溴乙啶的溶液浸泡，观察转膜效果）- 7）烘烤膜：120℃ 30分钟（或将膜RNA面朝下UV照射3-5分钟）。（注：可以在此步进行斑点杂交，以检验后边的步骤，在烤膜时应该用两张干净的滤纸包住，以防止膜在高温下转曲，发生交叉污染） 2、预杂交：加入杂交液，50℃ （或42℃）水浴3hr或过夜。（注：可以用68℃进行预杂交，而且应该预热杂交液，在预杂交和杂交时转速不能太快，大约8转/min，而且转膜面向内使之洗到膜） 3、杂交（2.5ml/100cm2）：在3ml杂交液中加入探针（10-100ng/ml），开始杂交16小时。（取标记探针约25ul，沸水加热10min，迅速冰浴，加入杂交液中混匀，并避免起泡，50℃ 或42℃水浴或过夜，探针量应该提高在0.5-3ug，注意杂交液一定要回收，可以反复利用） 4、洗膜、检测： 洗液Ⅰ （50ml/100cm2） 5min×2次 洗液Ⅱ （50ml/100cm2） 15min×2次，振荡洗涤（68℃） washing buffer 2min，换袋 blocking buffer（100ml/100cm2） 30min 150 mu/ml of anti-DIG-AP in blocking solution（稀释1:5000） 50ml, 30min washing buffer (100ml/100cm2) 15min×2次（除去未结合的Ab） detection buffer 20ml, 2-5 min（平衡膜） color solution (detection buffer 10ml + 管9 200ul，新鲜配制) 30min (5min-过夜)。显色期间不能晃动。显色完后，把膜浸入水中10分钟，干燥后保存。（注：应该放在黑暗密闭的容器中，避光、防止震荡） ＊含标记DNA的杂交液可于-20℃保存并重复使用。使用前将杂交液100℃沸水浴10分钟。 ＊二次杂交：将已杂交过的膜浸于二甲基甲酰胺中，50-55℃水浴脱色数分钟，用DEPC水漂洗后；除去探针：formamide,50%(v/v)，50mM Tris-HCl(pH8.0),SDS 1%(w/v)，将膜完全浸于液体中，68℃孵育1小时。在水中浸洗膜，然后置2×SSC。干燥膜或直接用于杂交。 ＊Quantification procedure: 用dilution buffer(管3)稀释试剂盒中DIG-标记的管1对照DNA（1:5,1:50,1:500,1:5000）与靶DNA探针（1:1,1:10,1:100,1:1000,1:10000），将其变性（沸水浴后迅速冰浴），各取1ul点到尼龙膜上，将膜于80℃ 2h或UV照射3分钟，按标准步骤进行染色、显色、照相。