动物总RNA的提取及含量测定

互联网2013-09-06

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一、实验目的 （1）了解制备RNA几种方法的原理及优缺点

（2）掌握稀碱法提取兔肝RNA的原理和操作技术

二、实验原理 细胞内大部份RNA均与蛋白质结合在一起，并且多以核蛋白的形式存在。因此，分离制备RNA时，首先遇到的是必须使RNA与蛋白解离，并除去蛋白质。由于RNA的种类来源和存在形式不同，所用的制备方法各异，一般常用的方法有，盐酸法，稀碱法和苯酚法。其中，以苯酚法使用较为广泛。产品纯度高，适合小规模生产。动物组织中以肝脏器官RNA含量较为丰富。本实验就是将兔肝组织匀浆，在酚与十二烷基硫酸钠的存在下，RNA与蛋白质分离使蛋白质变性凝固。RNA溶解在水相中，用乙醇使RNA从水相中沉淀，达到分离。RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖继而转变成糠醛，后者与3， 5-二羟甲苯反应呈鲜绿色，该反应需用三氯化铁和氯化铜作催化剂，反应产物在670nm处有最大吸收。RNA在20－250微克范围内，光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚反应特异性较差，凡是戊糖均有此反应。RNA和其他杂质也能给出类似的颜色。

三、试剂与器材 冰箱、恒温水浴、离心机、真空干燥器、煤气灯、冰盐浴等。

0.05mol/L醋酸缓冲液（PH5.0）、25%SDS、80％酚、2mol/L醋酸钠、95％乙醇RNA标准溶液、样品待测液、地衣酚试剂

四、操作方法

1、RNA 提取：将新鲜兔肝浸入预冷0度0.05mol/L醋酸钠缓冲液(PH5.0)中,除去肝脏处的结缔组织,除去血凝,用滤纸吸干,称取0.9克.(已称好)

2、取0.9克肝脏,加入 0.05mol/L醋酸缓冲液(PH5.0)9毫升,250克/升.SDS1.5毫升,移入匀浆管中,匀浆后再加入等体积80%酚,再匀浆一次.

3、移入三角瓶中,置65度水浴中继续振摇5-8分,取出流水冷却.

4、离心,3000转/分,10-15分,上层为稍混浊,含有RNA的水相,中层为变性蛋白,下层为酚液,管底残渣,含有RNA.吸出上层水溶液要RNA的收获量,可向中下层液中再加1/2体积的醋酸缓冲液,同样在65度水浴中振摇提取一次,离心后所收得的上层水液,可与上述水液合并,本次实验只提取一次.

5、用量筒测水液的量,加入1/10体积的2mol/L醋酸钠混匀.再加入2.5倍体积预冷的95%乙醇混匀,冷却放置絮状沉淀充分形成.

6、离心3000转/分,10分钟,倾出上清.

7、沉淀用蒸馏水4毫升溶解,慢慢向沉淀中加入蒸馏水,不断搅拌,至沉淀完全溶解即可,待作含量测定.

五、关键步骤与注意事项

① 一定要严格控制温度对RNA的影响 ② 防止核酸酶的降解作用