大片段DNA测序(50KB)

大片段DNA的测序: 通过鸟枪法 (Shot Gun Sequencing) 测序

鸟枪法测序的操作方法
1. 用限制酶切下目的片段的大片段Insert DNA, 并用Agarose凝胶电泳进行回收。
2. 对回收的大片段DNA用物理方法 (如超声波等) 进行切断处理，然后用T4 DNA Polymerase对小片段 DNA进行末端平滑化。
3. 进行Agarose电泳，切胶回收1 kbp ~ 2 kbp的小片段DNA。然后用BcaBest DNA Polymerase在DNA的 3'端加上一个A碱基。
4. 把加上A-tail的DNA片段连入T-Vector中，然后转化，挑选克隆。
5. 对阳性克隆（含1 kbp ~ 2 kbp Insert）进行DNA测序。
6. 对数据进行编辑，最后连成一条大片段的DNA序列。

DNA测序量
应该进行的DNA测序量以DNA片段实际长度的6-8倍量进行计算(针对实际片段大小确定测多少倍的覆盖率)，对每个反应的有效测序长度定义为600 Bases。
如：对100 kbp的DNA片段进行测序时，可以按以下方法进行计算：
6倍测序量＝100,000 Bases×6/600 Bases＝1000个反应
8倍测序量＝100,000 Bases×8/600 Bases＝1333个反应

结果编辑
按上述所示的DNA测序量要求进行DNA测序，然后对其所有结果进行编辑。此时的测序结果会连接成数个DNA大片段 (Contig)。
补缺工作
结果编辑工作结束后，会发现在数个DNA大片段 (Contig) 间的序列没有测定，此时应该通过primer walking来测序，进行整体DNA序列的补缺工作。