耐药质粒 DNA转化实验
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耐药质粒 DNA转化实验
本实验学习将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆,即转化子。
【原理】
受体菌Ecoli RRI 在低温条件下经Ca++ 处理,可改变细胞膜的通透性,利于受体菌对DNA的摄取,这种经Ca++ 处理的细菌称感受态菌。pBR322 质粒带有氨基苄青霉素(Ap)和四环素(Tc)基因,如将pBR322质粒转入到对上述抗生素敏感的Ecoli RRI菌体内,则可使该细菌获得Apr和Tcr,表现出对Ap和Tc的抗药性。
(一)感受态菌的制备
【材料】
1.菌株 E.coli RRI
2.LB 液体培养基
3.75mM Cacl2
4.其它:灭菌小试管、刻度吸管、微量加样器、离心机
【方法】
1.将细菌接种于5ml LB液体培养基中,37℃振荡培养16~20h。
2.取新鲜菌液,按1/100的接种量接种于LB培养基中,37℃振荡培养2~3h。
3.取1.5ml菌液,4℃ 3000rpm/min,离心5min,弃上清。
4.菌体沉淀加入750μl预冷的(4℃)75mmol/L CaCL2 溶液,轻轻吹打菌悬液,放冰浴30min。
5.4℃3000rpm/min,离心5min,弃上清。
6.菌体沉淀加入200微升预冷的75mmol/LCaCL2溶液,冰浴4min以上。4℃保存备用。
(二)质粒转化
【材料】
1.pBR322 质粒DNA,
2.感受态菌75mmol CaCl2
3.LB肉汤培养基,无药LB琼脂平板,氨苄青霉素琼脂平板(50ug/ml)
4.其它:灭菌小试管,L形玻璃棒
【方法】
1. 取2个洁净,灭菌的EP管,按表10-2加入各成分:
2. 上述2个试管充分混均匀后,置冰浴30min。
3. 42℃2min或37℃5min,立即置冰浴2min。
4. 加入1ml LB肉汤培养基,37℃静止培养1h。
(三)转化子筛选:
1.取实验组培养菌液涂布在氨苄青霉素琼脂平板(50ug/ml)上,对照组菌液分别涂布在无药LB琼脂平板和氨苄青霉素琼脂平板上,每块板涂0.1ml,用灭菌L形玻璃棒涂匀。将涂好的平板置370C培养过夜,观察转化结果。
2.E.coli 受体菌不含有质粒DNA,也不含Apr和Tcr 。在含Ap和Tc的培养基中不能生长,若实验组在含Ap和Tc的平板上出现菌落,可初步确定受体菌获得了耐药性质粒,然后再通过提取质粒DNA进一步鉴定转化子。