耐药质粒 DNA转化实验

耐药质粒 DNA转化实验
　　本实验学习将质粒DNA分子转入大肠杆菌的方法及如何筛选带有质粒DNA的细胞克隆，即转化子。 　　
　　【原理】
　　受体菌Ecoli RRI 在低温条件下经Ca++ 处理，可改变细胞膜的通透性，利于受体菌对DNA的摄取，这种经Ca++ 处理的细菌称感受态菌。pBR322 质粒带有氨基苄青霉素（Ap）和四环素（Tc）基因，如将pBR322质粒转入到对上述抗生素敏感的Ecoli RRI菌体内，则可使该细菌获得Apr和Tcr，表现出对Ap和Tc的抗药性。
　　（一）感受态菌的制备
　　【材料】
　　1．菌株 E.coli RRI
　　2．LB 液体培养基
　　3．75mM Cacl2
　　4．其它：灭菌小试管、刻度吸管、微量加样器、离心机
　　【方法】
　　1．将细菌接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养16~20h。
　　2．取新鲜菌液，按1/100的接种量接种于LB培养基中，37℃振荡培养2~3h。
　　3．取1.5ml菌液，4℃ 3000rpm/min,离心5min，弃上清。
　　4．菌体沉淀加入750μl预冷的（4℃）75mmol/L CaCL2 溶液，轻轻吹打菌悬液，放冰浴30min。
　　5．4℃3000rpm/min,离心5min，弃上清。
　　6．菌体沉淀加入200微升预冷的75mmol/LCaCL2溶液，冰浴4min以上。4℃保存备用。
　　（二）质粒转化
　　【材料】
　　1．pBR322 质粒DNA,
　　2．感受态菌75mmol CaCl2
　　3．LB肉汤培养基，无药LB琼脂平板，氨苄青霉素琼脂平板（50ug/ml）
　　4．其它：灭菌小试管，L形玻璃棒
　　【方法】
　　 1. 取2个洁净，灭菌的EP管，按表10－2加入各成分：　　　　　　　
2. 上述2个试管充分混均匀后，置冰浴30min。
3. 42℃2min或37℃5min，立即置冰浴2min。
4. 加入1ml LB肉汤培养基，37℃静止培养1h。
　　（三）转化子筛选：
　　1．取实验组培养菌液涂布在氨苄青霉素琼脂平板（50ug/ml）上，对照组菌液分别涂布在无药LB琼脂平板和氨苄青霉素琼脂平板上，每块板涂0.1ml，用灭菌L形玻璃棒涂匀。将涂好的平板置370C培养过夜，观察转化结果。
　　2．E.coli 受体菌不含有质粒DNA，也不含Apr和Tcr 。在含Ap和Tc的培养基中不能生长,若实验组在含Ap和Tc的平板上出现菌落，可初步确定受体菌获得了耐药性质粒，然后再通过提取质粒DNA进一步鉴定转化子。