Southern blot实验方法与步骤

用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA转移至一固相支持滤膜。利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。
（一） 器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。
（二） 试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20�SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针， 2�SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。

注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。
2、 消化好的样品点样于0.7％琼脂糖凝胶进行电泳；
注意：为保证DNA均匀分散于加样孔，应缓慢将样品加至加样孔。
3、 电泳结束后，将凝胶依次用如下试剂处理进行碱变性，室温下轻轻摇动确保溶液覆盖凝胶 0.25M HCl 10－15 min
蒸馏水摇洗 5 min
变性液 40 min
蒸馏水摇洗 5 min
中和液 15 min，2次；
4、 在凝胶碱变性的同时，制备转印迹装置。Southern blot转膜技术有三种：1），毛细管转移法；2），电转移法；3），真空转移法。这里介绍最经典的毛细管转移法（向上转移），在转印迹槽中，倒入20�SSC溶液，槽中置一固相支持物，在固相支持物上从下向上依次置入：两张与凝胶等宽的滤纸，将滤纸纵向自固相支持物垂于转印迹槽中（简称“桥”），底面在上的凝胶，滤膜（与凝胶等大），滤纸（与凝胶等大），吸水纸（略小于滤纸，5－8cm高），400－800g重物。凝胶四周用Parafilm膜包围防止短路。滤膜事先用2�SSC浸湿至少5 min。滤纸事先用20�SSC浸湿。转膜4－18小时；
注意：转膜装置中各层滤纸和膜之间要将气泡赶净。一旦建立转膜系统后，要防止滤膜和凝胶错位。防止吸水纸倒塌和完全湿透，要及时更换吸水纸。
5、 转膜结束后，取出滤膜，边角剪一小角做标记。滤膜于2�SSC摇洗5min，用滤纸吸干；6、 用紫外交联照射（正面朝上）或于80℃烤箱烘烤0.5－2小时；
7、 膜可立即进行预杂交和杂交，或保存于4℃待以后应用；
8、 预杂交和杂交
1） 将杂交膜浸湿于6�SSC 2min，同时预热预杂交液和杂交炉至预杂交温度；
2） 杂交膜封于杂交袋，按0.2ml/cm² 膜面积加入预杂交液，预杂交至少1小时；
3） 用于southern blot的探针可分为DNA探针、RNA探针和寡核苷酸探针。对探针的标记方法又可以分为放射性标记和非放射性标记。这里主要介绍非放射性地高辛标记探针的杂交方法。杂交时各种探针的用量：DNA探针，5－25ng/ml；RNA探针，100ng/ml；寡核苷酸探针，0.1－10pmol/ml。双链DNA探针提前100℃变性10min后迅速冰浴，单链探针无需变性。将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度。杂交温度的选择根据杂交液的不同而不同；
注意：应用寡核苷酸探针时，杂交温度的选择。Tm＝4�(G C) 2�(A T),杂交温度比Tm低约10℃。
4） 弃去预杂交液，将含探针的杂交液注入杂交袋，至少3.5ml/10�1℃m，置入杂交炉滚动；
9、 杂交后的洗膜处理过程，顺序如下：
2×洗液 2×15min
0.5×洗液 2×15min
1×缓冲洗液 1×3min
1×封阻液 1×60min
抗体液_1×30min
1×缓冲洗液 2×15min
1×检测液 1×5min
~undefined 抗－地高辛－碱性磷酸酶用1×封阻液稀释10，000倍（若用显色法稀释5000倍；若用CDP-Star检测用20，000倍稀释）；
10、将膜浸于CSPD液（CSPD用1×检测液稀释100倍，CDP-Star也用1× 检测液稀释100倍）室温避光静置 5min；回收剩余的CSPD液或CDP-Star液避光保存于4℃可反复应用3－5次；
11、将膜上残液吸净，用保鲜膜封好于37℃反应15min，然后将膜固定于压片夹，进行曝光。
注意：若用显色剂检测，新鲜配置显色剂（45μlNBT和35μl BCIP溶于10ml 1×检测液），将膜浸于显色剂中避光反应4－16小时，反应期间不要移动膜。