分子杂交技术（二）

 

四、核酸探针的标记和检测

　　分子杂交是核酸链间碱基配对规则的一种结合方式，是核酸的重要理化特性。利用分子杂交这一特性来对特定核酸序列进行检测，必须将杂交链中的一条用某种可以检测的分子进行标记，这条链就称为核酸探针。因此，核酸探针的制备是分子杂交技术的关键。最早采用的也是目前最常用的核酸探针标记方法是放射性同位素标记。常用的放射性同位素有32P和35S前者能量高，信号强，最常用。放射性同位素标记探针虽然敏感度高，但却存在辐射危害和半衰期限制（32P半衰期为14.3天，35S半衰期为87.1天，125I的半衰期为60天），3H的半衰期长达12.3年，但它所释放β放射线能量太低（0.018Mev），只能用于组织原位杂交。由于同位素标记的探针在使用过程中存在着上述缺点，近些年来，人们在寻找非航船性标记物方面取得了很大进展，国际上已有多家公司相继推出多种非放射性探针标记试剂盒，在国内也已具备生物素类标记物的生产能力，并有相应试剂出售。目前，非放射性标记物有下述几类：金属如Hg，荧光物质如FITC；半抗原如地高辛；生物素；酶类如辣根过氧化物酶（HRP）。半乳糖苷酶或碱性磷酸酶（AKP）等。不同的标记物，所标记探针的方法及检测方法也各异。下面仅就国际上较常用的，有实用价值或发展前景的几种核酸标记方法及其显示方法分两方面简述如下。

　　（一）核酸探针的常用酶促标记技术

　　1．缺口平移　该技术由Kelly等于1970年创立。其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口（nick ）,缺口处会形成3’―羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果是在缺口平移（nick tr－anslation）。根据这个原理，如果用高强度的放射性核苷酸（通常为α-32PdATP）置换先前存在的核苷酸，则可制备比活性高达108cpm（每分钟计数）/μg的32P标记DNA。用缺口平移法标记的DNA探针能满足大多数杂交要求。

　　2．DNA快速末端标记　大肠杆菌DNA聚合酶i 经枯草杆菌蛋白酶切割可得到两条多肽链，其中分子量为76kd的大片段称为Klenow片段。该酶具有完整聚合酶I的5’→3’聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性，但缺乏5’→3’核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填补由限制酶消解DNA所产生的3’凹陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3’末端。用Klenow片段标记末端一般只用一种[α-32P]dNTP，加入反应的[α-32P]dNTP取决于DNA末端延伸的5’末端序列，例如，用Ecor I切割DNA所产生的末端用[α-32P]dNTP标记。标记反应可在一种限制酶消解DNA后立即进行，不需去除限制酶或使其失活，也不需更换缓冲液，具有3’延伸的DNA末端不能被Klenow片段有效在标记，欲标记这类分子可用T4DNA聚合酶。

　　选用这种标记方法是为了产生可用于凝胶电泳时作大小参照物的DNA片段。因为标记的DNA片段与其摩尔浓度成比例，而不与片段大小成比例，在限制酶消化物中，小的和大的片段都以相同程度被标记。因此，可使用放射自显影术确定不有被溴化乙锭染色所观察到的大小DNA带，尤其适用于Southern吸印杂交时分子量标志物的标记。通过选择相应标记的dNTP，该法还可以只标记DNA分子的一端。例如，若DNA片段的两个末端分别是Bam H I和Hind III 粘膜端，在反应中只加入[α-32P]dNTP或[α-32P]dGTP，使可选择性标记两末端之一。

　　3．用T4多核苷酸激酶标记DNa 5’末端　寡核苷酸探针或短的RNA和DNA探针可选用此法标记，寡核苷酸探针一般多用这种标记。T4多核苷酸激酶（polynucleotide kinase, PNK）是由T4噬菌体感染的大肠杆菌中提取的，此酶能催化ATP的γ-磷酸转移至DNA或RNA的5’－OH末端。在过量ADP存在时，也可促进磷酸交换反应，使PNK将DNA末端5’磷酸转移到ADP上生成ATP，然后催化[α-32P]dNTP上的标记磷酸转移至DNA的5’末端，从而使DNA重新磷酸化，并藉此得到标记。显然，PNK标记DNA末端需要[γ-32P]dNTP，这与前述酶促标记方法不同。通常，对于5’磷酸化的DNA探针，要先用碱性磷酸酶去掉磷酸基团，然后再用于PNK催化的5’末端标记，这样标记效率较高。

　　4．随机引物延伸　这是以单链DNA或RNA模板合成高比活性32P标记探针所选用的方法。原理是使长6～8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I或反转录酶的作用下，以每一个退火到模板上的寡核苷酸片段为引物引发DNA链的合成，在反应时将[α-32P]dNTP掺入合成链，即得到标记。变性处理后，新合成链（探针片段）与模板解离，即得到无数各种大小的探针DNA。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板DNA随机发生退火反应，因此被称为随机引物（random primer）。这种随机引物可用小牛胸腺DNA或鱼精DNA制备。

　　用随机引物法标记的DNA探针或cDNA探针比活性显著高于缺口平移法，且结果较为稳定。这种方法尤其适用于真核DNA探针，因为随机引物来自真核DNA，其与真核序列的退火率要高于原核序列。因此，对于克隆的DAN探针，常先将插入探针DNA切下来回收后再标记，而缺口平移法可直接用于全质粒的标记。

　　5．聚合酶链反应（详见第二十二章）　聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）是一种分子生物学新技术，由美国Cetus公司人类遗传学部的Kary.B. Mullis于1985年创立。该技术利用两个与相反链杂交并随着于靶DNA两侧的寡核苷酸引物经酶促合成特异的DNA片段，包括模板变性，引物退火和引物延伸三个步骤的反复循环，最终两引物所夹靶DNA得到千万倍以上的扩增。因此 ，PCR技术已成为一项极为有价值的技术并已迅速推广应用。

　　PCR技术有许多重要用途，其中之一便是可用来标记高比活性DNA探针。PCR技术具有很高的特异性，可在1～2h之内在量合成探针DNA片段，如果在底物中加入[α-32P]dNTP或其它标记的dNTP，则探针DNA合成过程中可得到很好的标记，标记物的掺入率可高达70%～80%。因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该法的缺点是要合成一对特异性PCR引物。使用从探针DNA上制备的小片段作引物也能取得较好的标记效果。

　　（二）核酸探针的非放射性标记技术

　　1．光敏生物素标记核酸　目前使用的光标生物素试剂有两种：光生物素（乙酸盐）和补骨脂素生物素。它们都是由一个光敏基团、一个连接臂和一个生物素基团组成。光生物素的光敏基团是-N3，它在光作用下可与核酸中的碱基结合。补骨脂素生物素中的光敏基团补骨脂素在光照（320～400μm）下，可与单链或双链核酸发生反应，反应主要在T上，C上也有一定程度的反应。光敏生物素的连接臂含6～12个碳原子，用以减少探针杂交时的空间位阻。光敏生物素标记核酸，方法简单，灵敏度也可达到pg水平，可用于外源基因的检测。最近出现了一种新的光敏活性DNA生物素试剂，即生物素-聚乙二醇-当归素（BPA）。BPA的DNA结合部分是一个活性糖香豆素衍生物，在长波UV下它可与DNA碱基共价键结合。BPA反应物与DNA结合比光敏生物素更特异，在可见光下它不与核酸反应，这个特性可使BPA只标记粗制细胞裂解物中的核酸，而不标记蛋白、多糖和其他细胞大分子。

　　2．酶促生物素标记核酸　以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio �7 � dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应32P标记的脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入DNA。Bio-dUTP代替dTTP,Bio-dATP代替dATP，Bio- dCTP代替dCTP。Bio �11-dUTP的11是指生物素基团与脱氧核苷酸之间连接臂的碳链长度。常用的酶促生物素标记DNA的方法有缺口平移法和随机引物延伸法。

　　3．寡核苷酸的生物素末端标记　有5’-磷酸的化学标记法和3’-OH的酶促标记法。前者将寡核苷酸的5’-磷酸接上一个乙二胺，然后用琥珀酰亚胺生物素，将生物素基团连接在磷酸酰胺基上。后者是用末端转移将Bio-11�dUTP加于其3’-OH端（脱去一个焦磷酸）。

　　4．酶标DNA　标记试剂是辣根过氧化酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）。通过对苯醌（PBQ）与聚乙烯亚胺（PEI）连接而成（HRP-PBQ-PEI+），此试剂在戊二醛的作用下与变性的DNA结合，使HRP与DNA连接在一起，组成HRP标记的DNA探针。

　　5．酶标寡核苷酸　包括核苷酸5’末端标记HRP法和内部标记AP法。前者是在HRP中产生一个-HS反应基团，在寡核苷酸合成终了加在5’端，带一个C6的-HS基，与活化的HRP反应生成5’-HRP寡核苷酸。后者是在全成寡核苷酸过程中将一个5’带连接臂及CF3基团的尿苷3’亚磷酰亚胺合成在寡核苷酸链中，合成后此活化的寡核苷酸与AP反应即得到AP标记的寡核苷酸。

　　6．DNA半抗原标记　其原理与Bio-11-dTUP相同，只是用毛地黄甙代替生物素形成Dig �11- dUTP，酶促掺入DNA分子。用抗毛地黄甙抗体检测标记在DNA上的半抗原分子Digoxigenin（地高辛）

　　(三）非放射性探针的显示体系

　　1．AP显色体系

　　BCI �OH+NBT→紫色↓

　　ASO：等位基因特异的寡核苷酸，BCIP：5溴-4氯-3吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝，Pi：磷酸。

　　2．HRP显色体系

　　HRP + H2O2[HRP・H2O2]

　　ODA �NH2 +[HRP ・H2O2]�→ODA-N = ODA/棕色↓+HRP +H2O

　　ODA：邻-联茴香胺。

　　3．ABC显色体系

　　DNA �B + SA � AP→DNa � B � SA或DNa � B +SA - BAP→DNa �B �SA �BAP

　　经上述两反应，把AP连接在DNA上以后，再进行AP酶显色。这里SA为Streptavidin（链酶亲合素），BAP为生物素化的磷酸酶，B为生物素（biotin），ABC为Avidin � Biotin - Enzyme com－plex, 即亲合素- 生物素-酶复合物。

　　以上反应AP亦可用HRP代替。

表18-3�核酸探针的标记分子

标记物性质	标记分子	标记方法	杂交体的检测法
放射性分子	[α-32P]dNTP	NT、PCR、RPI	放射自显影或计数
	[γ-32P]dNTP	TL	放射自显影或计数
	125I	碘化	放射自显影或计数
	35S	NT	放射自显影或计数
	3H	NT	放射自显影或计数
非放射性分子
生物素	Bio-11-dUTP	NT、TL、PCR	酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色
	光敏生物素	600W 可见光照	同上
	生物素化补骨脂素	365nm紫外线照	同上
	生物素酰-e-氨基乙酸	化学合成法	同上
	N-羟基丁二酰亚胺脂		酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色
	生物素肼	化学合成法	酶标亲合素或酶标抗生物素抗体显色
酶	微过氧化物酶	直接法或合成法	直接底物显色或用酶标抗体+ 底物显色
	碱性磷酸酯酶	直接法或合成法	同上
荧光素	罗丹明和FITC	合成法	直接荧光显微镜观察或酶标抗体+ 底物显色
化学发光标记物			化学发光测量或自显影
抗双链单抗	酶标或荧光标记单抗	化学法	直接底物显色
稀有金属	Eu3－	化学法	时间分辨荧光
重金属	Ag	化学法
	Hg	化学法
半抗原	磺酸胞嘧啶	化学法	酶标单抗 + 底物显色
	地高辛	RPL	酶标抗体 + 底物显色

　　_：NT：缺口平移； PCR：聚合酶链反应；RPL： 随机引物标记； TL：末端标记

　　4．非放射发光自显影　　若将AP或HRP的显色底物根据光化学原理换成一种酶解后产生光子的化合物，可用自显影技术暴光X线片显示。

　　（1）HRP发光自显影：氨基苯-甲酰肼在HRP与H2O2的作用下氧化为氨基苯二甲酸，同时放出N2及发光（波长428nm）。发光时加入某些酚的衍生物时可增强发光上千倍。反应如下图：

　　（2）AP的发光自显影：AP的发光底物是金刚烷二氧丁环磷酸盐（AMPPD），它含有磷酸酯键在AP的作用下水解下一个磷酸，进而由分子内过氧键提供能源分解产生金刚酮和激发态的甲基间-氧苯甲酸阴离子，当此阴离子恢复到基态时发出光子。可用波拉黑白片（621型）直接暴光显影。显影信号强度比BCIP/NBP显色法强两上数量级。是很前景的显示体系。

　　其发光反应的原理如下：

　　HRP的发光原理：

　　

　　AP的发光原理：