质粒的制备

 

质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或表达的主要载体，它在基因操作中具有重要作用。质粒的分离与提取是最常用、最基本的实验技术。

质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解、质粒DNA的分离和纯化。本实验以碱裂解法为例，介绍质粒的抽提过程。

实验目的：掌握碱裂解法抽提质粒的原理、步骤及各试剂的作用。

实验材料：含有质粒pUC18载体的大肠杆菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大肠杆菌菌液。

实验原理：在pH 12.0 ~ 12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，然后用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

实验步骤：

1.   取含有pUC18质粒的大肠杆菌菌液于LA培养基上37℃过夜培养；

2.   用无菌牙签挑取单菌落，接种于含有Amp抗生素的LB培养基中，37℃摇床~250 r/min过夜培养；

3.   吸取1.5 ml菌液，12000 g离心2分钟，收集菌体，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次收集菌体，尽量将菌液倒干净；

4.   加入300 ?l溶液 I振荡打匀，重新悬浮细胞，震荡混匀（注意：应彻底打匀沉淀或碎块）；

5.   加入300 ?l溶液II，轻柔颠倒混匀，放置至清亮，一般不超过5分钟；

6.   加入300 ?l溶液III颠倒混匀，放置于冰上10分钟，使杂质充分沉淀；

7.   12000 g离心10分钟；

8.   吸取800 ?l上清液（注意：不要吸取到飘浮的杂质）至另一Eppendorf管中，加入2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟；

9.   12000 g 常温离心15分钟；

10.   倒尽上清，加75％乙醇浸洗除盐（放置片刻或离心3分钟后倒去上清）；

11.   室温放置或超净台上风干DNA；

12.   加40 ?l灭菌超纯水或TE溶解；

13.   质粒、BAC的质量检测，于-20℃保存。

附注：质粒检测

电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型

吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。