小鼠肝基因组DNA制备的实验方法

 

DNA以核蛋白形式存在于细胞核中，制备DNA的原则是既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。蛋白酶K及链霉蛋白酶E的应用使这两个原则得到了保证。

蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为广谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA存在下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA分子分离，EDTA抑制细胞中DNase活性，蛋白酶K或链霉蛋白酶E将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。再用酚、酚／氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染。最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNase除去RNA。获得高分子量DNA的关键是防止DNase降解DNA。故标本必须新鲜，在提取前细胞就保持完整，核、溶酶体等细胞器应没有明显破坏，提取DNA用的离心管等器皿及试剂应消毒。操作在4℃以下进行。

操作

1．组织DNA的提取

① 取小鼠新鲜肝组织，去除结缔组织，用剪刀剪成细小碎块

② 加10倍体积TE缓冲液，用玻璃匀浆器在冰浴中中速匀浆；将匀浆液转入10ml离心管以4000rpm离心10分钟，弃上清；加10倍体积TE洗一遍，以4000rpm离心10分钟，弃上清

③ 加适量TE稀释

④ 取400μl稀释液于1.5ml的Eppendorf管，缓慢加入10％SDS溶液，至终浓度0.5％  (加20μl)，摇匀直至溶液变粘稠

⑤ 加入Rnase(200μg/ml)至终浓度20ug/ml(42μl)混匀，置37℃保温60分钟（总体积 420μl)。

⑥ 加蛋白酶K(20mg/ml)至终浓度100ug/m1混匀(加21ul)，于50℃保温3小时，并间歇搅动(总体积441μl)。

⑦ 将此溶液冷却至室温，加等体积饱和酚抽提，以10000rpm离心10分钟；取上清加1/2体积饱和酚，1/2体积氯仿/异戊醇抽提一次，以10000rpm离心10分钟；取上清，加等体积氯仿/异戊醇抽提一次，以10000rpm离心10分钟；加1/10体积5MKAc，加2倍体积无水乙醇充分混匀，以12000rpm离心10分钟

⑧ 加lml70％乙醇洗沉淀，以12000rpm离心10分钟

⑨ 待酒精挥发尽后加20ul TE溶解，4℃储存

2．电泳鉴定

取DNA样品2μl加上样缓冲液10μl (含溴酚蓝指示剂和甘油)，在0.8％琼脂糖凝胶进行水平微型电泳，电压<5V/cm，时间2小时左右。电泳后取出凝胶，用0.5μg/ml的溴化乙锭染色20分钟，用紫外灯观察分析。

试剂及器材

1．试剂

蛋白酶K：称取20mg蛋白酶K溶于1ml消毒双蒸水中，-20℃备用。

RNase(牛胰)：称取10mgRNase溶于1ml下列混合液中：10mmol/l Tris-HCl，pH8.0； 1mmol/L EDTANa2 pH8.0；50％甘油。

10％SDS溶液：称取10gSDS溶于100ml消毒双蒸水中，于65℃保温2小时，贮存室温备用。

1×TE缓冲液(pH8.0)：10mmol/L Tris-HCl pH8.0；1mmol/LEDTANa2 pH8.0。配制后高压灭菌，4℃贮存。

1×TE饱和重蒸酚(pH8.0)

氯仿/异戊醇(24:1V/V)

10mol/LNH4AC，配制后高压灭菌，4℃贮存

无水乙醇(AR)

70%乙醇

2．器材

玻璃匀浆器；离心机；电泳仪；电泳槽；紫外透射反射分析仪