PCR引物设计及软件使用技巧

PCR引物设计及软件使用技巧
张新宇，朱有康，高燕宁
（中国协和医科大学中国医学科学院肿瘤研究所，北京100021）

摘要：本文旨在介绍使用软件设计PCR引物的技巧。在PCR引物设计原则的基础上，详
细介绍了两种常用引物设计软件的基本使用方法，并对其各自的优缺点进行了比较。一般性
引物自动搜索可采用“PremierPrimer5”软件，而引物的评价分析则可采用“Oligo6”软件。
关键词：PCR；引物设计
中图分类号：Q524文献标识码：文章编号：
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自从1985年KarnyMullis发明了聚合酶链式反应以来，PCR技术已成为分子生物学研
究中使用最多、最广泛的手段之一[1]，而引物设计是PCR技术中至关重要的一环。使用不
合适的PCR引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚
体带），不出带或出带很弱，等等。
现在PCR引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，得
到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。一般来说，专门进行PCR
引物设计的专业软件功能更为强大，但使用起来却不太容易。本文将就引物设计原则及软件
使用问题进行探讨。
引物设计的原则
引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避
免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即
错配)。
具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primerlength），产物长度
（productlength），序列Tm值(meltingtemperature)，引物与模板形成双链的内部稳定性
(internalstability,用?G值反映)，形成引物二聚体(primerdimer)及发夹结构（duplex
formationandhairpin）的能值，在错配位点（falseprimingsite）的引发效率，引物及产物的
GC含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，
引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：
1.引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延
伸温度大于74℃，不适于TaqDNA聚合酶进行反应[2]。
2.引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导
致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增
加[2]。
3.引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配
位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应
当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反
应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。
4.引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC
含量不能相差太大[2][5]。
5.引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种
方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(thenearest
neighbormethod)[6][7]。
6.?G值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定
性。应当选用3’端?G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间?G值相对较高的引
物。引物的3’端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应[6]。
7.引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且
降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行[8]。
8.对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR产物的载
体的相应序列而确定。
值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC
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含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的PCR因为产
物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条
件。
引物的自动搜索和评价分析
软件的引物设计功能主要体现在两个方面：首先是引物分析评价功能，该功能只有少数
商业版软件能够做到，其中以“Oligo6”最优秀；其次是引物的自动搜索功能，各种软件在
这方面的侧重点不同，因此自动搜索的结果也不尽相同。据笔者的经验，自动搜索功能以
“PremierPrimer”为最强且方便使用，“Oligo6”其次，其他软件如“VectorNTISuit”、
“Dnasis”、“Omiga”和“Dnastar”都带有引物自动搜索功能，但搜索结果不是十分理想。
要想得到效果很好的引物，在自动搜索的基础上还要辅以人工分析。笔者认为引物设计软件
的最佳搭配是“Oligo”和“Premier”软件合并使用，以“Premier”进行自动搜索，“Oligo”
进行分析评价，如此可快速设计出成功率很高的引物。
PrimerPremier5.0的使用技巧简介
1.功能
“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计()、
限制性内切酶位点分析()和DNA基元(motif)查找()。“Premier”还具有同源
性分析功能（），但并非其特长，在此略过。此外，该软件还有一些特殊功能，其中
最重要的是设计简并引物，另外还有序列“朗读”、DNA与蛋白序列的互换（）、
语音提示键盘输入（）等等。
有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸（20种常见
结构氨基酸中的18种）的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸序列反推DNA序列时，会
遇到部分碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列
组成大部分相同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚
结构的不同而异，比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模
板DNA的来源以相应的遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结
构的不同遗传密码规则供用户选择，有纤毛虫大核（CiliateMacronuclear）、无脊椎动物线粒
体（InvertebrateMitochondrion）、支原体（Mycoplasma）、植物线粒体（PlantMitochondrion）、
原生动物线粒体（ProtozoanMitochondrion）、一般标准（Standard）、脊椎动物线粒体（Vertebrate
Mitochondrion）和酵母线粒体（YeastMitochondrion）。
2.使用步骤及技巧
“Premier”软件启动界面如下：
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其主要功能在主界面上一目了然（按钮功能如上述）。限制性酶切点分析及基元查找功
能比较简单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元（如-10序列，-35序列
等），按确定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新
限制性内切酶或基元。
进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
进一步点击按钮，出现“searchcriteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目
的（SeachFor）有三种选项，PCR引物（PCRPrimers），测序引物（SequencingPrimers），
杂交探针（HybridizationProbes）。搜索类型(SearchType)可选择分别或同时查找上、下游引
物（Sense/Anti-sensePrimer，或Both），或者成对查找（Pairs），或者分别以适合上、下游
引物为主（CompatiblewithSense/Anti-sensePrimer）。另外还可改变选择区域（Search
Ranges），引物长度（PrimerLength），选择方式（SearchMode），参数选择（SearchParameters）
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等等。使用者可根据自己的需要设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然
后按，随之出现的SearchProgress窗口中显示SearchCompleted时，再按，
这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式，上游引物（Sense），下游引物
(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣次序（Rating）排列，满分
为100，即各指标基本都能达标（如下图）。
点击其中一对引物，如第1#引物，并把上述窗口挪开或退出，显示“PeimerPremier”
主窗口，如图所示：
该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些
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性质，最下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构（Hairpin），二聚体（Dimer），错误引
发情况（FalsePriming），及上下游引物之间二聚体形成情况（CrossDimer）。当所分析的引
物有这四种结构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的
窗口中就会出现该结构的形成情况。一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最
好的情况是最下面的分析栏没有，只有。值得注意的是中间一栏的末尾
给出该引物的最佳退火温度，可参考应用。
在需要对引物进行修饰编辑时，如在5’端加入酶切位点，可点击，然后修改
引物序列。若要回到搜索结果中，则点击按钮。
如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规
则，反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。
总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易
使用，是一个相当不错的软件。
Oligo6.22使用技巧简介
1.功能
在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容
易被其复杂的图表吓倒。Oligo5.0的初始界面是两个图：Tm图和ΔG图；Oligo6.22的界
面更复杂，出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物
设计。但它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。
2.使用（以Oligo6.22为例）
Oligo6.22的启动界面如下：
图中显示的三个指标分别为Tm、ΔG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6
至7个碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发
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的可能性。因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows
菜单改为tili方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo
5.0，只是显示更清楚了。
经过Windows/Tili项后的显示如图：
在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉得合适，可点击Tm图块上左
下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上游引物已选
取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成Lower。?G值反映了序列与模板的结
合强度，最好引物的?G值在5’端和中间值比较高，而在3’端相对低（如图：）
Tm值曲线以选取72℃附近为佳，5’到3’的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线
为“Oligo6”新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选
用3’端Frq值相对较低的片段。
当上下游引物全选好以后，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查
引物二聚体尤其是3’端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或
下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成（crossdimer）。二聚体形成的能值
越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，
因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；
与二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。
当然，在设计克隆目的的PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，
而且能值不会太低。这种PCR需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹
结构的检测就不应要求太高。第三项检查为GC含量，以45-55％为宜。有一些模板本身的
GC含量偏低或偏高，导致引物的GC含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游
引物的GC含量以及Tm值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基
因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最好还进行Falseprimingsite的检测。这项检查
可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较
高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发效率以不超过100为好，但对于特定的
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模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的
引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130，那么这对引物也是可以接受的。
当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位
置、产物大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。
由于“Oligo”软件的引物自动搜索功能与“PrimerPremier5”的相类似，并且似乎并
不比后者更好用，在此不再赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求
去寻找最佳引物，如果参数设置得当将大大提高工作效率。
除了本地引物设计软件之外，现在还有一些网上引物设计软件，如由WhiteheadInstitute
开发的“Primer3”等（本网站
http://210.72.11.60 已引进并调试好该软件，欢迎使用）。该
软件的独特之处在于，对全基因组PCR的引物设计；可以将设计好的引物对后台核酸数据
库进行比对，发现并排除可引发错配的引物。因此建议经常做全基因组PCR的用户试用。
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