酶联免疫检测技术的应用现状和发展前景

互联网2013-09-06

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酶联免疫检测技术的应用 真菌毒素的检测：黄曲霉毒素 B 1 、 M 1 以及 T-2 毒素，脱氧雪腐镰刀菌烯醇（呕吐毒素 DON ），二乙酰草镰刀菌烯醇（ DAS ），玉米赤霉烯酮，赫曲霉毒素 A （ OA ）。 农药的检测：主要有除草剂与杀虫剂两大类，例如杀暝松（ FN ）、甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、草不绿（ Alachor ）、西维因（ Carbaryl ）、多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。 其他类的检测：盐酸克伦特罗，河豚毒素，植物毒素如�粟硷、吗啡、藻类毒素，苯并（ a ）芘，抗生素，激素类以及一些营养物质和食品添加剂如麸蛋白（ Gliaclin ），酱油蛋白（ Soy protein ），花生蛋白（ Peanut protein ），牛乳清蛋白（ Borine Whey Protein ）等。 随着食品工业的发展，对分析检测的要求越来越高，从而也使 ELISA 方法将更趋完善。一方面为提高 ELISA 方法的灵敏度和特异性，制备单克隆抗体的技术的发展，将和 ELISA 法互相结合，从而使食品卫生分析达到 DNA 分子结构水平，促使食品工业的健康发展。 1 放射免疫分析(RIA) 放射免疫法(Radioimmunoassay,RIA)优点是特异性强、灵敏度高、精确、简便易行。它包括以标记抗原(Antigen, Ag)为特点的放射免疫分析(Radioimmunoassay,RIA)和以标记抗体(Antibody, Ab)为特点的免疫放射分析(Immunoradiometric assay ,IRMA)。前者以液相竞争结合法居多，既测大分子抗原又测小分子抗原；后者以固相法测大分子抗原为主。 最早建立的农药免疫法中，RIA占了很大比重，建立了狄氏剂、艾氏剂、2,4-D和2,4，5-T、对硫磷和百草枯等农药的放射免疫法。但由于进行RIA需使用昂贵的计数器，存在放射性防护和废物处理等问题，其应用受到较大限制。1982年后发表的农药免疫分析文章，主要是酶免疫分析法。 2 酶免疫法(EIA) 酶免疫法(Enzyme Immunoassay, EIA)是将抗原、抗体的特异性免疫反应和酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。酶免疫法的检测原理与放射免疫法类似，通过测定结合于固相的酶的活力来测定被测定物的量。用作标记物的酶有辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)和碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)。酶标试剂制备容易、稳定、价廉。酶免疫分析的灵敏度接近放射免疫技术，而可借助于简单的仪器作定量测定，是目前农药监测中应用最广泛的免疫分析技术。 EIA法包括酶联免疫吸附分析法(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA)、酶免疫试验法(Enzyme-monitored Immunotest , EMIT)、竞争结合酶免疫分析法(Competitive Binding Enzyme Immunosorbent Assay, EIA)和免疫酶分析法(Immunoenzymometric Assay, IEMA)。其中基于竞争吸附的ELISA已成为农药监测中的首选方法。 美国环境保护机构(USEPA)开发了野外便携式和实验室ELISA方法，其主要目标是建立便于野外监测危险污染物的简便方法。监测的靶分析物包括多氯联苯、苯、甲苯和二甲苯混合物、硝基芳烃化合物、对硫磷、carbaryl和其它杀虫剂。美国食品药物管理局(USFDA)主要将ELISA集中于食品和饲料中农药残留的检测，开发了天然霉素(黄曲霉素)的免疫分析，目前正在研究用于检测phenamaphos和carbendazine 等化合物的检测方法。美国农业食品安全检查部门(USFSIS)资助开发了除草菊酯、有机氯杀虫剂及其它化合物的免疫分析法，并采用现有的方法来完成其监测任务。

近年来，Immunosystems Inc.已生产出了几种ELISA试剂盒，其靶分析物包括杀虫剂、杀菌剂和除草剂。这种试剂盒配上便携式分光光度计可实现野外定量快速测定，检测灵敏度为0.03～25ppb。便携式ELISA试剂盒检测程序见图1。 随着ELISA在农药监测中的应用范围的不断扩大，一些新方法也不断涌现。Hall等用EIA法检测了水样中的污染物2,4-D,三嗪，Merolachlor并将其与气相色谱分析结果进行比较。Roda [4] 等利用EIA对环境水样中苯并芘进行了测定。 Hong利用ELISA对土壤和水中三氮杂苯类除草剂进行了测定。Hutchinson等利用ELISA检测土壤中的EPTC。Wittmann用酶免疫分析法检测残留在食品中的三嗪。Weller [5] 通过改变温育时间，提高了ELISA检测三氮杂苯类除草剂的灵敏度。我国的研究者也自行开发了一些ELISA法。刘长武 [6] 应用ELISA对梨、苹果中的对硫磷残留进行了测定。余万俊 [7] 制备了杀虫脒的特异性抗体，并以此抗体建立了大米中杀虫脒残留的单克隆抗体ELISA检测法。阳传和 [8] 应用B淋巴细胞杂交瘤技术，研究出特异性强的T-2毒素的单克隆抗体，并建立了小麦T-2毒素的ELISA方法。周永新等 [9] 进行了蓖麻毒素多克隆抗体的研究。 ELISA的快速发展，主要是由于其高度的重现性、灵敏度和较短的分析时间所决定的。许多环境化合物的特异性单克隆和多克隆抗体的制备及应用为ELISA的快速发展奠定了基础。 3 荧光免疫分析(FIA) 本世纪40年代，Coons采用荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原，首次创建了荧光抗体检测技术。荧光免疫法具有专一性强、灵敏度高、标记物不易失活、价格低廉、无放射性污染等优点。至今，FIA已广泛应用于微量、超微量物质分析测定。FIA常用的荧光素有异硫氰酸酯(Fluoresceine isothiocyanate , FITC)和罗丹明(BLissamine Rhodamine B200, RB200)等。将荧光免疫与光纤传感器结合形成的荧光免疫传感器是近年来荧光免疫法研究十分活跃的领域。荧光免疫传感器是将抗体(抗原)固定在适当基底上，实现生化荧光信号向光电信号的转变，以对待测物质进行定量检测。测定环境中农药残留的分子识别元件可以是AchE [10] 抗体 [11] 和碱性磷酸酶等。 Rogers等 [12] 将FITC标记的AchE固定在石英纤维上以检测酶的活性。乙酰胆碱水解时产生的H + 猝灭纤维表面的荧光信号，荧光强度减弱。有机磷农药抑制AchE的活性，从而降低荧光猝灭能力，可检测溶液中10 -8 mol . L -1 的AChE抑制剂，其响应时间小于1min。Anis等将有机农药对硫磷抗体和FITC标记的Anti-IgG Ab蛋白固定在石英纤维上制得荧光免疫传感器。测定对硫磷的检测限为10 -9 mol . L -1 。Schulman利用竞争性荧光能量转移法原理，用FITC标记的多克隆氯乙异丙嗪(atrazine)抗体，用四甲基罗丹明标记农药氯乙异丙嗪，研制出光纤免疫传感器，通过增加能量转移的量改善了灵敏度。Northrup [13] 利用光纤免疫传感器检测农药中拟除虫菊酯(pyrethroide)。Bier等 [14] 以荧光和损耗波作用为基础，研究了光纤传感器对三嗪衍生物terbutryn的灵敏度和再生性，检测限0.1ng/mL，可稳定使用8周以上并可循环测定500次。Robert等 [15] 应用损耗波光纤为基础的免疫传感器还可直接检测地面水中ng/mL水平的蓖麻毒素。这类传感器有很高的特异性，然而对分子量小的有机磷农药，特别是有机磷神经性毒剂，较难诱导出高质量的抗体，加之生物材料在固定化过程中的可能失活等原因使其应用尚不及EIA普遍。目前国内尚无此类工作报道。

荧光免疫分析中的其它发展还有时间分辨荧光多组份免疫分析法的建立及时间分辨荧光免疫分析中荧光效应的研究。 一、检测的原理 　　借助抗原和抗体在体外特异结合后出现的各种现象，对样品中的抗原或抗体进行定性、定量、定位的检测。 1．抗原与抗体的亲和力(affinity)抗原抗体的结合就像酶与底物的结合，激素与其受体的结合一样不是化学的反应，而是非共价键的可逆的结合。抗原决定簇和抗体分子可变区互补构型，造成两分子间有较强的亲和力。空间构型互补程度不同，抗原和抗体分子之间结合力强弱也不同。互补程度高，则亲和力强。此外，反应温度、酸碱度和离子浓度对抗原和抗体分子上各基因的解离性和电荷特性也有重要的影响，抗体与抗原决定簇之间的结合力大小可用亲合力来表示。高亲合力的抗体与抗原的结合力强，即使抗原浓度很低时也有较多的抗体结合抗原形成免疫复合物。 2．抗原或抗体外检测原理根据抗原抗体结合形成免疫复合物的性状与活性特点，对标本中的抗原或抗体进行定性、定位或定量的检测。定性和定位检测比较简单，即用已知的抗体和待检样品混合，经过一段时间，若有免疫复合物形成的现象发生，就说明待检样品中有相应的抗原存在。若无预期的现象发生，则说明样品中无相应的抗原存在。同理也可用已知的抗原检测样品中是否有相应抗体。 　　对抗原或抗体进行定量检测时，以反应中加入抗原和抗体的浓度与形成免疫复物的浓度呈函数关系。 　　（ 1）根据免疫复合物产生的多少来推算样品中抗原（或抗体）的含量：在一定的反应条件下，加入的已知抗体（或抗原）的浓度一定，反应产生的免疫复合物多少与待检样品中含有相应抗原（或抗体）量成正比。也就是抗体浓度一定时，免疫复合物越多则样品中的抗原量也越多。可用实验性标准曲线推算出样品中抗原（或抗体）的含量。如免疫单向扩散试验、免疫比浊试验和酶联免疫检测等都属于这类方法。 　　（ 2）抗原或抗体效价滴定的原理：当抗原抗体复合物形成多少不能反应抗原抗体反应强弱时，就不能以检测反应强度来对抗原或抗体进行定量。在实际工作中，把浓度低的反应成分（抗原或抗体）的浓度固定，把浓度高的另一种反应成分作一系列稀释。例如用人血清作抗原免疫3只家兔，比较3只家兔产生抗体的多少，即滴定3只兔血清抗体效价，可用双向琼脂扩散法来滴定，例如将抗体浓度固定，将抗原作不同的稀释度，分别将抗原或抗体滴入琼脂的相应小孔中，观察免疫兔血清与不同稀释度的抗原出现明显沉淀浅的抗原稀释度（如甲兔的抗体效价为1/2000，而丙免的是1/8000则可比较出后者比前者产生抗体的效价要高）。也就是表示效价的稀释度越高，样品中所含待检成分越多。因人血清（抗原）和抗体（免疫兔血清）相比，浓度高，故应稀释抗原。

二、抗原或抗体检测的实用意义 1．抗体检测的意义检测抗体可用于评价人和动物免疫功能的指标。抗体用于临床治疗或实验研究时也需做纯度分析和定量测定。临床上检测病人的抗病原生物的抗体、抗过敏原的抗体、抗HLA抗原的抗体、血型抗体及各种自身抗体，对有关疾病的诊断有重要意义。 2．抗原检测的意义可做为抗原进行检测的物质可分为以下四类： 　　（ 1）各种微生物及其大分子产物：用于传染病诊断、微生物的分类及鉴定以及对菌苗、疫苗的研究。 　　（ 2）生物体内各种大分子物质：包括各种血清蛋白（如各类免疫球蛋白、补体的各种成分）、可溶性血型物质、多肽类激素、细胞因子及癌胚抗原等均可做为抗原进行检测。在对这些成分的生物学作用的研究以及各种疾病的诊断有重要意义。 　　（ 3）人和动物细胞的表面分子：包括细胞表面各种分化抗原（如CD抗原）、同种异型抗原（血型抗原或MHC抗原）、病毒相关抗原和肿瘤相关性情抗原等。检测这些抗原对各种细胞的分类、分化过程及功能研究、对各种与免疫有关的疾病的诊断及发病机制的研究，均有重要意义。 　　（ 4）各种半抗原物质：某些药物、激素和炎症介质等属于小分子的半抗原，可以分别将它们偶联到大分子的载体上，组成人工结合的完全抗原。用其免疫动物，制备出各种半抗原的抗体，应用于各种半抗原物质的检测，例如对某些病人在服用药物后进行血中药物浓度的监测。对运动员进行服用违禁药品的检测，都是应用半抗原检测的方法。 　　三、抗原或抗体检测的方法 　　由于各种检测方法中所用的抗原性状不同，出现结果的现象也不同。最广泛应用方法有下述几种： 　　（一）沉淀反应 　　可溶性抗原与抗体结合，在两者比例合适时，可形成较大的不溶性免疫复合物。在反应体系中出现不透明的沉淀物，这种抗原抗体反应称为沉淀反应（ precipitation neaction）。 1．环状沉淀试验　　先将含抗体的未稀释的免疫血清加到直径小于 0.5cm 的小试管底部。将稀释的含有可溶性抗原的材料重叠于上，让抗原与抗体在两液体的界面相遇，形成白色免疫复合物沉淀环，故名为环状沉淀试验（ ring precipitationtest）,此法简便易行，需用材料较多是其缺点。 2．单向免疫扩散试验　　单向免疫扩散试验（single immunodiffusion）是在凝胶中进行的沉淀反应。将抗体混入加热溶解的琼脂中，倾注于玻片上，制成含有抗体的琼脂板，在适当位置打孔，将抗原材料加入琼脂板的小孔内，让抗原从小孔向四周的琼脂中扩散，与琼脂中的抗体相遇形成免疫复合物。当复合物体积增加到一定程度时停止扩散，出现以小孔为中心的圆形沉淀圈，沉淀圈的直径与加入的抗原浓度成正相关。本方法简便，易于观察结果，可测定抗原的灵敏度（最低浓度）约为10～20μg/ml，常用于定量测定人或动物血清IgG、IgM、IgA和C3等，其缺点是需1～2天才能看结果。

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