时间分辨荧光免疫分析技术的研究进展及在食品安全领域中的应用

 

随着分析方法的飞速发展，无论是食品中有毒有害物质，还是环境中痕量元素的检测，或者生物体内功能因子的分析，都迫切需要一种灵敏度高、快速准确、性能稳定的痕量分析方法。时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay，简称为TRFIA）是20世纪80 年代中期发展起来的一种新的荧光标记技术。这种方法应用某些特殊的稀土金属，能够区分背景光的散射所引起的干扰，从而大大地提高了分析的灵敏度。与传统的酶免疫法（EIA）、发射免疫分析法（RIA）相比，它具有很多优点:灵敏度高达10-19；稳定性好，克服了酶和放射性荧光物质的不稳定性；动态范围宽；试剂货架期长；无放射性危害等,时间分辨荧光分析目前被公认为是灵敏度最高的分析方法之一[1,2]。

 

一、时间分辨荧光免疫分析法的原理及优势

时间分辨荧光免疫分析法（TRFIA）是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析法[3]。它利用了具有独特荧光特性的镧系元素及其螯合物为示踪物，标记抗体、抗原、激素、多肽、蛋白质、核酸探针及生物细胞，以代替传统的荧光物质、酶、同位素、化学发光物质。用时间分辨荧光免疫分析检测仪测定反应产物中的荧光强度，根据产物荧光强度和相对荧光强度的比值，准确地测定反应体系中被分析物的浓度。TRFIA 所使用的荧光标记物是镧系稀土金属[4]，由于镧系稀土金属离子螯合物有很长的荧光寿命(微秒级)，有别于传统荧光的短荧光寿命，使其能通过时间分辨方式区别于背景荧光（钠秒级），正是由于荧光衰变时间长，可以延缓测量时间，待测样品中短寿命的本底荧光衰变后再测稀土离子的特异荧光，因此可完全消除本底荧光的干扰。镧系稀土金属离子螯合物荧光很宽的Stokes 位移使其容易通过波长分辨方式进一步区别于背景荧光，提高方法学的稳定性。镧系稀土金属离子螯合物狭窄的荧光发射峰使其荧光检测具有很高的效率，进一步提高了信号检测的特异性和灵敏性。此外，由于检测时加入了荧光增强液，它可使原来荧光增强100万倍，以上各种因素使TRFIA 的检测灵敏度和准确性大大提高。

二、TRFIA 的反应模式

目前在实践中应用的主要有固相双位点夹心法和竞争法。夹心法多用于蛋白质类大分子化合物的测定，竞争法多用于小分子半抗原的检测。反应模式流程如下：

1、双抗体夹心法（检测抗原）

一抗包被、封闭→加入检测样品→加入Eu3+标记的二抗→加入增强液→检测。

2、竞争法（检测抗体）

抗原包被、封闭→加入一抗/检测样品→加入Eu3+标记的二抗→加入增强液→检测。

三 、传统TRFIA 的改进

1、酶放大的时间分辨荧光免疫分析法

Papanastsiou-Diamandi等[5]报道这种分析技术，其原理与常规方法完全不同。本方法以碱性磷酸酶催化底物5- 氟水杨酸磷酸酯（FSA），FSA 与稀土离子Tb3+ 作用生成FSA－Tb3 + -EDTA 三元复合物。结合后的Tb3+在紫外光激发下可发出很强的荧光信号。不加增强液即可在时间分辨荧光仪上测量Tb3+ 的特征荧光。近年，我国赵启仁等[6,7]也利用酶放大的时间分辨荧光分析法进行核酸杂交和碱性磷酸酶的测定，灵敏度达到10pg。

2、链霉亲和素-生物素(SA-biotion)系统的时间分辨荧光免疫分析法

由于链霉亲和素（SA）不带糖基、等电点低，在检测中具有比亲和素(AV)低的背景而大大提高了检测的灵敏性。SA-biotin系统可偶联抗原、抗体、报告酶、寡核苷酸分子以及PE等荧光物质，因此，SA-biotin被广泛用于生物反应检测系统，用以检测抗原、抗体及核酸分子[8]。 Andreas Rossler[9]利用链霉亲和素-生物素系统的时间分辨荧光分析法检测人体血液中玻尿酸的含量，灵敏度达到小于0.24mg/L也能检测出来。血液中的玻尿酸的含量可以作为许多疾病诊断的标志，对于许多疾病的前期诊断具有很大的意义。

3、多标记技术的研究

TRFIA的多标记测量是目前标记技术中独一无二的，其利用不同镧系离子间的荧光波长和荧光衰变时间的差异，引入了两种或两种以上的镧系离子标记物，通过时间分辨荧光测量，同时检测样品中的多种物质[10]。Eu3+在TRFIA中的使用率最高，常用于双重标记的镧系离子有两对[11]：一对是 Sm3+和Eu3+，另一对是Eu3+ 和Tb3+。90年代，Xu等开发出的几种共用荧光增强液（CFES）使得两种以上的标记成为可能，而且不影响测量的灵敏度。多标记测定技术具有省时、省试剂和血样的特点，可用于检测多种分子的筛查实验和一些珍贵样品的检测[12]。

4、固相TRFIA 技术的改进

为克服DELFIA体系缺点，Evagelista等[13]人建立的固相TRFIA技术，它以4,7- 二氯磺基苯-1,10 啡啉-2,9 二羧酸（BCPDA）为螯合剂，制备稀土标记免疫复合物。由于BCPDA分子结构具有增强荧光作用，无需加增强液，可直接检测稀土标记免疫复合物的荧光。潘利华[14,15]等也通过BCPDA新型双功能螯合剂标记BSA，对抗稀土污染的固相TRFIA系统的深入研究，将对稀土自然丰度高的我国，减少荧光背景干扰，提高荧光检测灵敏度，具有潜在意义。

5、与其它技术的联用

（1）与PCR 技术联用

时间分辨荧光免疫分析技术与PCR技术相结合，可用于检测特异的靶DNA 序列，简称PCR-TRF，使PCR产物的鉴定简便易行。常用的方法[16]有：套叠式PCRTRF、双标记PCR 法、PCR-TRFS直接定量法、时间分辨荧光扫PCR与TRFIA联用来检测病毒的核酸。Dahlen 报道，用Eu3+标记寡核苷酸引物进行PCR的扩增实验，扩增产物中带有Eu3+标记引物，可直接用荧光测定仪进行定量分析，不需要再进行琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色等步骤，使实验操作过程大为简化且提高了PCR的灵敏度和特异性。

（2）与激光技术联用

激光- 时间分辨技术是脉冲激光和荧光检测系统相结合而产生的。利用该技术进行放射性核素U和稀土元素Eu等已有报道，检出限Mg/L～ng/L。于水等 [17～19]利用该技术已建立了Al 、Zn 、Mg 、Cd 的激光- 时间分辨荧光测定方法。7-碘-8-羟基喹啉-5-磺酸（Ferron）和8- 羟基喹啉-5- 磺酸（H2QS）是两种广络性试剂，它们可以与等金属离子形成荧光络合物。根据这些络合物当在不同介质中，不同增敏剂、掩蔽剂作用下产生不同的荧光特性，从而在多种物质共存时检测某种离子，比如当1.0ml 0.01% H2QS，pH10 的NH4Cl-NH3OH 缓冲液时，Al3+几乎不产生荧光，而Mg2+荧光强度最强，灵敏度比提高20倍。即使其他离子高出400倍共存时，也几乎不影响测量结果。

（3）与流动注射分析技术联用

Feng[20]和钱昌顺[21]利用流动注射分析技术（FIA）进行纯化分离待测物质，再利用TRFIA技术检测。建立了癌胚抗原（CEA）检测的新的分析方法。这样既结合了FIA 的进样操作简单和在线分离检测等优点，也利用了TRFIA 高灵敏度的特点，使常规的CEA 检测时间从几个小时缩减至几分钟，从而可以作为一种替代传统ELISA 和反射免疫分析的方法。

（4）与电脑技术的联用

随着电脑技术的发展，国外TRFIA的测量仪器已经实现了高度自动化，操作软件也逐步人性化，界面简单，易懂。国内也有几种仪器推出，实现了硬件的国产化，此外，光纤技术的引入，使得时间分辨荧光免疫分析成为一种名副其实的新型超微量分析技术[22]。

四、时间分辨荧光免疫分析法在临床医学上的应用

1、先天性甲状腺功能低下症的检测

先天性甲状腺功能低下症,是由于先天因素使甲状腺发育异常或代谢障碍,不能产生足够的甲状腺素引起生长发育减慢,智力发育迟缓,TRFIA法是对其进行早期诊断的有效方法[23～25]。

2、唐氏综合症的检测

近几年，运用TRFIA 技术，利用孕妇血清生化标记物进行产前唐氏症筛查，作为一种无创伤性检查手段[26]。研究妊娠相关血浆蛋白A 在早孕妇女血清中的变化对唐氏综合症,流产的早期诊断和监测有较高的价值[27]。

3、在肿瘤学方面的应用

通过测定肿瘤标志物水平，来检测肿瘤疾病。比如甲胎蛋白（28）、癌胚抗原（29）、糖类抗原CA125（30）和前列腺特异性抗原PSA[31]等。

4、用于病原微生物抗原抗体的检测

TRIFA已经广泛的应用于各种传染性疾病的检测和研究中，比如，甲肝病毒（HA）、乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒、脑炎病毒、SARS等流感病毒、呼吸道合胞病毒、轮状病毒、风疹病毒、免疫缺陷病病毒及出血热病毒等[32～37]。

五、时间分辨荧光免疫分析法在食品安全上的应用

1、食品中致病微生物的检测

Escherichia coli O157:H7会引起出血性大肠炎和溶血性尿毒症综合症。Yu 等[38]运用TRFIA 技术测定苹果汁中Escherichia coli O157:H7 的数量。应用一种类似夹心ELISA 的方法，以免疫磁珠为固相载体，用Eu 标记抗体，最终通过Eu 激发的荧光用TRFIA 分析检测仪检测荧光强度，Escherichia coli O157:H7含量与荧光强度成一定线性关系。最低检测量达到101CFU/ml，并且当大量的Escherichia coli K-12共存时，也不会影响Escherichia coli O157:H7的检测灵敏度，证明用TRFIA技术特异性高，能够针对不同菌种进行检测，而不互相干扰。检测时间短，直接检测时间只要2 h 。

2、食品中生物毒素的检测

Lei 等[39]利用一种类似于间接竞争ELISA 的TRFIA技术对微囊藻毒素进行检测。检测范围为0.01ng/m到l10ng/ml，灵敏度是ELISA 的20 倍，大大优于ELISA 方法，并且有很高的重现性和准确性。黄飚等[ 4 0 ]也利用TRFIA 技术建立快速的高灵敏度的赭曲霉毒素A(OTA)全自动检测方法。研究表明，OTA-TRFIA 是目前报道的O T A 检测中最灵敏的方法，该分析方法稳定性好，可测范围宽，具有很好的应用前景。

3、食品中有害金属物质的检测

于水等利用激光- 时间分辨荧光建立了Al、Zn、Mg、Cd的测定方法。Dang等[41]利用激光-时间分辨荧光分析仪对微量物质进行检测，该方法干扰小，灵敏度高，可用于食品和环境中有害金属物质，功能因子以及有害物质的微量检测。

 六、TRFIA 在食品安全检测中的发展前景

随着人们对食品安全的要求越来越高，国际社会上对食品中有毒有害物质的检测越来越严格，各种有毒有害物质的限量标准也在不断提高。近年来我国食品被进口国拒绝、扣留、退货、索赔和终止合同的事件时有发生，1999 年8 月至2000 年1 月，我国共有634 批出口食品，因不符合美国政府的技术法规，遭到美国食品和药物管理局（FAD）扣留。更加突出的问题为：我国畜禽肉(特别是冻鸡)长期因兽药残留问题而出口欧盟受阻；茶叶由于农药残留问题而出口多国受阻；输韩鸭肉因含有禽流感病毒而受阻；酱油由于氯丙醇污染问题而影响了向欧盟和其他国家出口。为了解决出口食品受阻和严格控制有害进口食品进入国门，保证人民的身体健康，必须找到灵敏准确的检测方法。

TRFIA 是随着免疫分析和化学分析的发展而成孰起来的一种新的检测方法。作为一种灵敏度高、特异性好、安全的超微量分析测定方法，目前已广泛而成熟地应用在临床医学领域，同时也在食品安全领域崭露头角，用于快速检测食品中的大肠杆菌O157:H7、赭曲霉毒素A 、微囊藻毒素和有害金属等。相信随着检测设备的广泛应用和各种检测试剂盒的不断开发，TRFIA 将在食品安全领域发挥更大的作用。

参考文献：

[1] 戴长生.Anytest-2000 时间分辨荧光分析仪介绍[J].标记免疫分析与临床,2005,12(2): 121-122.

[2] 韩玲,陈杞,游冬青.镧系元素时间分辨荧光分析技术及仪器的配套研究[J].中国医疗器械信息,2004,10  (6): 19-23.

[3] 李振甲,陈洋藻,高平,等.时间分辨荧光分析技术与应用[M].科学技术出版社,1996.

[4] 吴冯波.时间分辨荧光免疫分析――原理与实践[J].化学通报,2005,68: 105.

[5] Apanastasiou-Diamandi A,Christopoulous T K,iamandis E P.Ultrasensitive thyrotropin immunoassay based on enzymatically amplifiedtime-resolved fluoresence with a terbiumchelate[J].Clin Chem,1992,38: 545-548.

[6] 赵启仁,李美佳,刘洁.核酸杂交的酶放大时间分辨荧光分析[J].中国医学科学院学报,2002,24(1): 84-88.

[7] Qi-ren Zhao,Mei-jia Li,Jie Liu,et al.Enzyme-amplified lanthanide luminescence assay of alkaline phosphatase[J].Prog Biochem Biophys,1998,25(1): 71-74 .

[8] Feng-Bo Wu,You-Feng He,Shi-Quan Han.Matrix interference in serum
total thyroxin T4 time-resolved fluorescence immunoassay TRFIA and its elimination with the use of streptavidin-biotin separation technique[J].Clinica Chimica Acta,2001,308: 117-126.

[9] Andreas Rossler.An μltrasensitive,nonisotopic immunoassay for hyaluronan using the streptavidin-biotin system Clinica Chimica Acta,1998,270: 101-114.

[10] 秦秋平.多标记时间分辨荧光免疫分析及其应用[J].标记免疫分析与临床,1994,(4): 233-236.

[11] Kimura H,Mukaida M,Wang G,et al.Dual-labeled time-resolved fluoroimmunoassay of psychopharmaceuticals and stimulants in serum[J].Forensic Sci Int,2000,113(1-3): 345-351.

[12] Ito K,Oda M,Tsuji,et al.Simultaneous determination of alphafetoprotein,human chorionic gonadotropin and estriol in serum of pregnant women by time-resolved fluoroimmunoassay[J].Pharm Biomed Anal,1999,20(1-2): 169-178.

[13] Evangelista R A,Pollak A,Allore B,et al.Clin[J].Biochem,1988,21:173.

[14] Li-hua Pan,Jin-long An,Wen-bing Xie,et al.Study of rare earth bifunctional chelate BCPDA-Eu3+ labeling protein[J].Spectroscopy and Spectral Analysis,2004,24(7): 795-798.

[15] 潘利华,曾春慧,关铭,等.镧系络合物的双向螯合剂――BCPDA的性质研究[J].光谱学与光谱分析,2003,23(5): 903-906.

[16] 游冬青,陈杞,赵启仁.TRF检测法在核酸分析中的应用[J].国外医学―放射医学核医学分册,1996,20(4): 161-164.

[17] ShuiYu,etal.Laser-timeresolvedfluorimetrideterminationofzinc (Ⅱ)and aluminum(Ⅲ)[J].Environmental Monitoring in China,1997,13(5): 21-24.

[18] ShuiYu,etal.Laser-timeresolvedfluorimetricdeterminationofcadmium[J].Environmental Monitoring in China,1997,13(3): 7-9.

[19] ShuiYu,etal.Laser-timeresolvedfluorimetrideterminationofmagnesium(Ⅱ)and aluminum(Ⅲ)[J].Chinese Journal of Analytical Chemistry,1996,24(4): 433-435.

[20] Ya-na Feng,Jian-nong Zhou,Jie-hua Lin.Flow injection immunoassay forcarcinoembryonic antigen combined with time-resolved fluorometric detection[J].Journal of Immunological Methods,2005,305: 120-127.

[21] 钱昌顺.流动注射-时间分辨荧光联用检测CEA[J].现代检验医学杂志,2005,20(2): 38-39.

[22] 张黎明,李招云,李婉红,等.AutoDelfia 时间分辨荧光免疫分析仪的初步评价[J].江西医药,2005,40(9): 561-562.

[23] 韩宝生,孙琳杰,吴剑华.唐山市新生儿苯丙酮尿症与先天性甲状腺功能减低症发病现状分析与研究[J].中国妇幼保健,2005,20:2109-2112.

[24] 傅清流,郑发明,洪星.新生儿先天性甲状腺功能低下症筛查分析[J].中国优生与遗传杂志,2004,12(2): 84-85.

[25] Feng-Bo Wu,Shi-Quan Han,Tao Xu.Sensitive time-resolved fluoroimmunoassay for simultaneous detection of serum thyroid-stimulating hormone and total thyroxin with Eu and Sm as labels[J].Analytical Biochemistry,2003,314: 87-96.

[26] 刘兰女.提高唐氏综合症产前筛查质量工作的探讨[J].中国优生与遗传杂志,2005,13(10): 11-13.

[27] 董源芬,宋扬.应用时间分辨荧光法测定妊娠相关血浆蛋白A的临床意义[J].中国优生与遗传杂志,2005,13(12): 55-56.

[28] 邓光荣,赵万春,蔡中祥.时间分辨荧光免疫法测定血清AFP的方法学评价[J].标记免疫分析与临床,2005,12(4): 239

[29] 骆燕,王文,李兰英.超敏感hAFP、CEA 对消化系良恶性疾病诊断的评价[J].中国微循环,2004,8(6): 378-380.

[30] 杭建峰,吴英松,徐伟文,等.CA125时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制[J].热带医学杂志,2005,5(5): 567-571.

[31] 李宁,沈菁,伍严安,等.时间分辨荧光分析法检测总PSA和游离PSA的应用评价[J].福建医药杂志,2005,27(2): 118-119.

[32] 谭成,蔡刚明,黄彪.乙型肝炎表面抗体的时间分辨荧光免疫分析[J].中华实验和临床病毒学杂志,2005,19(3).

[33] 爱萍,朱雪明,单卫民.丙型肝炎病毒抗体的时间分辨荧光分析法检测[J].临床检验杂志,2001,19(4): 215.

[34] 王蕾,吴英松,汤永平,等.应用时间分辨荧光免疫分析技术检测SARS 病毒抗原的初步研究[J].第一军医大学学报,2005,25(4): 429-433.

[35] P A Christopher Maple,Cerys S Jones.Time-resolved fluorometric immunoassay for rubella antibody―ausefulmethodforserosurveillance studies[J].Vaccine,2002,20: 1378-1382.

[36] Kotaniemi-Syrjanen,Laatikainen,WarisM,etal.Respiratorysyneytial virus in fection in children hospitalized for wheezing: Virus-specific studied frominfancytopre school years[J].ActaPaediatrintJPaeduatr,2005,94(2): 159-165.

[37] Siitari H,hemmila I,Soini E,et al.Detection of hepatitis B surface anrigen using time-resolved fluoroimmunoassay[J].Nature,1983,301: 258-260.

[38] L S L Yu,S A Reed,M H Golden.Time-resolved fluorescence immunoassay (TRFIA)for the detection of Escherichiacoli O157:H7 in applecider[J].Journal of Microbiological Methods,2002,49: 63-68.

[39] La-Mei Lei,Ying-Song Wu,Nan-Qin Gan,et al.An ELISA-like time resolved fluorescence immunoassay for microcyst in detection[J].Clinica Chimica Acta,2004,348: 177-180.

[40] Biao Huang,Wen-Yi Tao,Lian-Fen Zhang.Ultrasensitive time-resolved fluoroimmunoassay of ochratoxin A[J].Prog Biochem Biophys,2005,32(7): 662-666.　

[41] Jian-ming Dang,Ke-quan Wang,Wei-zhuang Jia,et al.Model LMA-3 laseranalyzerfortracesubstances[J].RockAndMineralAnalysis,1994,13(3): 227-232.