人TLR-4(TLR-4)ELISA试剂盒 说明书
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人TLR-4 ( TLR-4 )ELISA 试剂盒
原理
本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA 法。用抗人 TLR-4 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 TLR-4与单抗结合，加入生物素化的抗人 TLR-4 ，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在 450nm 处测 OD 值，TLR-4 浓度与 OD 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中TLR-4 浓度。
试剂盒组成 （ 2-8 ℃保存）
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酶标 板 （Coated Wells ） |
96 孔 |
酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate ） |
12ml |
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10×标本稀释液（ Sample Buffer ） |
12ml |
20×浓缩洗涤液（ Wash Buffer ） |
50ml |
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标准品 （Standards ） ： 10ng/瓶 |
2 瓶 |
底物工作液（TMB Solution ） |
12ml |
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第一抗体工作液（ Biotinylated Antibody ） |
12ml |
终止液 （Stop Solution ） |
12ml |
准备试剂与收集血样
1. 收集标本：血清、血浆（EDTA ）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测， 2-8 ℃ 保存48 小时；更长时间须冷冻（ -20 ℃或 -70 ℃ ）保存，避免反复冻融。
2. 标准品液配制：使用前加入0.5 ml 蒸馏水 混匀，配成 20ng/ml 的溶液 。 设标准管 8 管，第一管加标本稀释液 900ul ，第二至第八管加入标本稀释液 500ul 。在第一管中加入 20ng/ml 的标准品溶液 100ul 混匀后用加样器吸出 500ul ，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出 500ul 弃去。第八管为空白对照。
3. 10× 标本稀释液用蒸馏水作 1: 1 0 倍稀释（ 示例： 1ml浓稀释液 +9ml 蒸馏水）。
4. 洗涤液：用重蒸水 1:20 稀释（示例：1ml 浓缩洗涤液加入 19ml 的重蒸水）
标本激活方法
1. 将450ul 标本稀释液加入到一支 1.5ml 进口聚丙烯管中 , 再加 10ul 血清或血浆标本。
2. 加20ul 1 N HC I ,盖紧，上下混匀。 2 － 8 ℃ 放置60± 2 分钟。
3. 加20ul 1 N NaOH, 盖紧，上下混匀。
4. 即用，或放-20/-70 ℃ 保存3 天。计算结果时乘 以稀释倍数 50 。 （ 注意：不同的标本TLR-4 的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）
5. 细胞培养上清或组织匀浆 10 倍稀释 (410ul 的标本稀释液＋ 50ul 样本＋ 20ul 的 1N HCI+20ul 的 1N NaOH) 。
检测程序
1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活） 100ul ，将反应板充分混匀后置 37 ℃ 120 分钟。
2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干。
3. 每孔中加入第一抗体工作液10 0ul 。将反应板充分混匀后置 37 ℃ 6 0 分钟。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶标抗体工作液100ul 。将反应板置 37 ℃ 3 0 分钟。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul ，置 37 ℃ 暗处反应15 分钟。
8. 每孔加入100ul 终止液混匀。
9. 30分钟内用酶标仪在 45 0 nm 处测 吸光值。
结果计算与判断
1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行计算。
2. 以标准品20 00 、100 0 、500 、 250 、 125 、 62.5 、 31.2 、 0 pg /ml 为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。
3. 根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 TLR-4 含量 ，再乘上稀释倍数即可 。
试剂盒性能
1. 灵敏度 ： 最小的TLR-4 检测浓度小于 15 pg/ml。
2. 特异性： 可同时检测重组或天然的人 TLR-4 。 不与 人其它细胞因子有交叉反应。
3. 重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。
注意事项
1. 以上标准孔及待 测 样品均建议做复孔，每次测定应同时 做 标准曲线。
2. 洗涤过程 很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及 OD 值错误地升高。
3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持 板条干燥 。
4. 本试剂盒宜置 4 o C冰箱保存。
5. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！
