小鼠核转录因子p65(NF-kB p65)ELISA试剂盒 说明书

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小鼠核转录因子p65 ( NF - kB p65 )ELISA 试剂盒

 

原理

本实验采用双抗体夹心  ABC-ELISA 法。用抗小鼠   NF- kB   p65单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的   NF- kB  p65 与单抗结合，加入生物素化的抗小鼠NF- kB p65 ，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在 450nm 处测 OD 值，NF- kB p65 浓度与 OD 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中NF- kB p65 浓度。

试剂盒组成 （ 2-8 ℃保存）

酶标 板 （Coated Wells ）	96 孔	酶标抗体工作液（Enzyme Conjugate ）	12ml
10×标本稀释液（ Sample Buffer ）	12ml	20×浓缩洗涤液（ Wash Buffer ）	50ml
标准品 （Standards ） ： 10 ng/瓶	2 瓶	底物工作液（TMB Solution ）	12ml
第一抗体工作液（ Biotinylated Antibody ）	12ml	终止液 （Stop Solution ）	12ml

准备试剂与收集血样

1.  收集标本：血清、血浆（EDTA ）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测， 2-8 ℃ 保存48 小时；更长时间须冷冻（ -20   ℃或 -70   ℃ ）保存，避免反复冻融。

2.  标准品液配制：使用前加入0.5 ml 蒸馏水 混匀，配成 20ng/ml 的溶液 。 设标准管 8 管，第一管加标本稀释液 900ul ，第二至第八管加入标本稀释液 500ul 。在第一管中加入 20ng/ml 的标准品溶液 100ul 混匀后用加样器吸出 500ul ，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出 500ul 弃去。第八管为空白对照。

3.  10× 标本稀释液用蒸馏水作 1: 1 0 倍稀释（ 示例： 1ml浓稀释液 +9ml 蒸馏水）。

4.  洗涤液：用重蒸水 1:20 稀释（示例：1ml 浓缩洗涤液加入 19ml 的重蒸水）

标本激活方法

   1.    将450ul 标本稀释液加入到一支 1.5ml 进口聚丙烯管中 , 再加 10ul 血清或血浆标本。

 2.    加20ul 1 N HC I ,盖紧，上下混匀。 2 － 8 ℃ 放置60± 2 分钟。

     3.    加20ul 1 N NaOH, 盖紧，上下混匀。

     4.    即用，或放-20/-70 ℃ 保存3 天。计算结果时乘 以稀释倍数 50 。 （ 注意：不同的标本NF- k B p65 的水平可能有较大差异，请根据实际情况灵活掌握稀释度）

      5.   细胞培养上清或组织匀浆 10 倍稀释 (410ul 的标本稀释液＋ 50ul 样本＋ 20ul 的 1N HCI+20ul 的 1N NaOH) 。

检测程序

1.  加样：每孔各加入标准品或待测样品（已激活） 100ul ，将反应板充分混匀后置 37 ℃ 120 分钟。

2.  洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干。

3.  每孔中加入第一抗体工作液10 0ul 。将反应板充分混匀后置 37 ℃ 6 0 分钟。

4.  洗板：同前。

5.  每孔加酶标抗体工作液100ul 。将反应板置 37 ℃ 3 0 分钟。

6.  洗板：同前。

7.  每孔加入底物工作液100ul ，置 37   ℃ 暗处反应15 分钟。

8.  每孔加入100ul 终止液混匀。

9.  30分钟内用酶标仪在 45 0 nm 处测 吸光值。

结果计算与判断

1.  所有 OD 值都应减除空白值后再行计算。

2.  以标准品20 00 、100 0 、500 、 250 、 125 、 62.5 、 31.2 、 0  pg /ml 为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3.  根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 NF- kB p65 含量 ，再乘上稀释倍数即可 。

试剂盒性能

   1.    灵敏度 ： 最小的NF- kB   p65 检测浓度小于 15 pg/ml。

2.  特异性： 可同时检测重组或天然的小鼠 NF- kB p65 。 不与 小鼠其它细胞因子有交叉反应。

3.  重复性：板内、板见变异系数均小于8.9％。

注意事项

   1.    以上标准孔及待 测 样品均建议做复孔，每次测定应同时 做 标准曲线。

 2.   洗涤过程 很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及 OD 值错误地升高。

   3.    板条开封后剩余板条要再封好，保持 板条干燥 。

   4.   本试剂盒宜置 4 o C冰箱保存。

 5.    本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！