非损伤微测技术测定液泡H+流速的方法

液泡膜H ⁺ 运输的传统测定方法是通过pH荧光染料进行体外检测完成的。然而，该方法中高纯度的液泡膜分离复杂，且对微弱的H ⁺ 实时监测的灵敏度不够，成为影响研究人员使用的原因。近年来，非损伤微测技术（NMT）已经广泛地应用于电生理研究中。NMT具有非损伤、高灵敏度和实时监测整个过程的优点。迄今为止，虽然通过NMT已经测定了甜菜液泡的Ca ²⁺ 流，但还没有对液泡H ⁺ 流速的测定报道。因此，建立液泡以及细胞膜系统H ⁺ 流速测定的方法，对研究质子的运动和膜蛋白活性具有重要意义。

2011年，中科院植物所李银心研究组对非损 伤微测技术（NMT）测定液泡H ⁺ 流进行了方法上的若干修正，使得NMT可以更准确地对液泡H ⁺ 流进行测定。同时，研究中使用新建立的体系测定NaCl应激下转基因烟草TS15和WT烟草的液泡H ⁺ 流速差异，并用NMT方法测定液泡膜上H-ATPase和PPase的活性。研究首先根据NMT的可视化测定的特性，简化了液泡提取方法，省略了传统检测中繁琐的超速离心的步骤。在200mM NaCl胁迫下，H ⁺ 外流增加，但是TS15的H ⁺ 外流要显著强于WT的外流，说明在转基因植株中NHX1具有更高的活性。在200mM NaCl条件下施加ATP和PPi，液泡△H ⁺ 流速的变化反映H-ATPase和PPase的活性大小；研究表明，在施加ATP后，转基因烟草液泡表现出更大的△H ⁺ 流速；该结果说明转基因植株比WT植株在200mM NaCl条件具有更高的V-ATPase活性。同时，用传统方法计算H-ATPase和PPase酶活结果也证实了NMT测定的准确性。与传统荧光方法相比，NMT从操作的流程，结果精度和结论的信息量上都具有更大优势。

本研究建立和修正了一种适合和精确的液泡H ⁺ 流速的测定方法。用离子流差异还可以反映更多的生理特征，是一种可以替代传统V-ATPase和PPase的活性测定方法的新手段。这种简单的方法将来能够广泛地进行亚细胞和细胞器水平离子流速的检测和分析。

参考文献：Chen XY , et al . Analytical Biochemistry, 2011, 418: 295–297.

关键词：非损伤微测技术，H ⁺ 流速，SeNHX1 ，液泡

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图注：在正常和200mMNaCl盐激下SeNHX1 转基因和WT烟草液泡的H ⁺ 净流速。