甲基化干扰法鉴定与蛋白结合的DNA位点
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放射性标记 DNA 探针的制备
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
1． 按照（三）中操作流程灌制非变性聚丙烯酰胺凝胶。将 10 × TBE 稀释成 0.5 ×的工作浓度。聚丙烯酰胺的工作浓度取决于待测 DNA 片段的大小， 200bp 左右的片段需要 4 ～ 5 ％的凝胶，小于 100bp 的片段应灌制 6 ～ 8 ％的凝胶。
l DNA 的标记
1． 用两种限制性内切酶从 10 μ g 质粒上将待测 DNA 片段切下。注意务必使至少一种酶酶切后产生 5’ 凸出末端。酶切体系终体积 50 μ l ，在适宜的酶反应缓冲液条件下反应 1 小时。
2． 向酶切反应混合液中加入
[ α－ 32 P]dATP （约 10 μ Ci/ μ l ） ( 若 5’ 凸末端含 T 残基 ) 10 μ l
dCTP(2mmol/L) 1 μ l
dGTP(2mmol/L) 1 μ l
dTTP(2mmol/L) 1 μ l
DNA 聚合酶（ Klenow 片段）（ 5 单位 / μ l ） 1 μ l
室温温育反应体系 30 分钟。
3． 加入 7 μ l 10 ×上样缓冲液终止反应。
l 标记探针的分离
1． 将反应混合物上样于非变性凝胶。
2． 10 ～ 15V/cm 条件下，用 0.5 × TBE 缓冲液电泳 2 ～ 3 小时。
3． 将玻璃板从电泳槽中取出，分开，并使凝胶粘附于其中任一块板上。用保鲜膜将凝胶覆盖起来。
4． 将凝胶室温下对 X 光片曝光 1 分钟。小心操作使得显像后的 X 光片与凝胶能以曝光时方位复原。
5． 用保鲜膜覆盖在放射性自显影照片上。再将带凝胶的玻璃板放在其上，以照片为模板，用刀片切下含标记 DNA 片段的凝胶片。将该凝胶片切成小片（约 1mm2 ）后，放入微量离心管中。
6． 向管中加入 1ml 洗脱缓冲液， 37 ℃连续振荡，温育过夜。
7． 将洗脱液转入两个干净微量离心管中（每管 500 μ l ），然后各加入 1ml 100 ％乙醇，－ 80 ℃放置 10 分钟。室温离心 15 分钟沉淀 DNA 。
8． 弃上清，用 80 ％乙醇洗沉淀，室温离心 5 分钟，用长颈巴斯德吸管移去上清，再用真空离心蒸发浓缩器或干燥器干燥沉淀。
9． 用闪烁计数器测定样品中的契仑科夫辐射量。将沉淀溶于适量 TE 中使标记探针的浓度为约 104 cpm/ μ l 。
甲基化反应
1． 室温下，于微量离心管中建立如下列反应（每一 DNA 片段需 6 个离心管， 3 个用于起始反应， 3 个用于终止反应）
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管 1 C 反应 |
管 2 为结合的 G 反应 |
管 3 A ＋ G 反应 |
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起始反应液 |
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DMS 缓冲液 |
200 μ l |
200 μ l |
－ |
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H2 O |
－ |
－ |
18 μ l |
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载体 DNA |
1 μ l |
1 μ l |
1 μ l |
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DNA 探针 |
1 μ l |
10 μ l |
2 μ l |
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管 4 C 终止 |
管 5 G 终止 |
管 6 A ＋ G 终止 |
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终止反应液 |
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DMS 终止液 |
50 μ l |
50 μ l |
－ |
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醋酸钠（ 0.3mol/L; pH7.0 ） |
－ |
－ |
200 μ l |
|
乙醇（ 100 ％，冰预冷） |
1mol |
1mol |
1mol |
2． 在 1 号和 2 号管中加 1 μ l DMS ，并加 3 μ l 10 ％甲酸于 3 号管中起始反应。
3． 将 1 号和 2 号管在 16 ℃下放足 4 分钟， 3 号管在 37 ℃温育 15 分钟。加入适量终止液终止反应。
4． 剧烈振荡离心管并置于干冰 / 乙醇浴 6 分钟。
5． 4 ℃离心 7 分钟。
6． 用长巴斯德吸管弃上清，用 1ml 100 ％乙醇清洗沉淀。
7． 室温下离心 3 分钟。
8． 弃去上清。
9． 用干燥器或真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀， 2 号管的 DNA 沉淀用于结合反应， 1 号及 3 号管保存于－ 20 ℃备用。
蛋白 /DNA 结合反应
l 聚丙烯酰胺凝胶的制备
灌制 5 ％非变性聚丙稀酰胺凝胶，用 10 × TGE 配制 TGE 终浓度为 1 ×的凝胶。
l 结合反应
1． 用 23 μ l H2 O 溶解已干燥、甲基化的、标记的 DNA 沉淀（ 2 号管）。
2． 加入：
poly(dI-dC) • poly(dI-dC)(1 μ g/ μ l) 2 μ l
蛋白提取液 10 ～ 20 μ l
结合缓冲液（ 10 ×） 5 μ l
加水至终体积为 50 μ l
3． 室温下，进行 30 分钟的结合反应。
4． 加 3 μ l 上样缓冲液到样品中并上样 5 ％非变性聚丙酰胺凝胶。
5． 在 1 × TGE 10V/cm 下电泳 2 ～ 3 小时，分离游离的和与蛋白结合的 DNA 片段。
6． 从电泳槽中移出玻璃板并将两玻璃板分开使胶附着于一玻璃板上，用 Saran® 膜覆盖在胶上。
7． 室温下凝胶对 X 光片曝光 1 ～ 2 小时，小心放射自显影胶片显像后，使胶片正确地与凝胶原位重合。
放射性标记 DNA 带的洗脱
1． 用 Saran® 保鲜膜包裹放射自显影胶片并放在一次性白色托盘上。展开凝胶并将支撑凝胶的玻璃板放在显像过的胶片上，使得玻璃板的角和胶片的角对齐，显像后的胶片为模板，用刀将含有放射性标记 DNA 片段（包括游离和与蛋白结合的片段）的聚丙烯酰胺凝胶的带块切下。
2． 将 1.5g 琼脂糖溶于 100ml 1 × TBE 中，微波炉加热熔化后冷却至 60 ℃时灌制凝胶，配成 1.5 ％琼脂糖胶一块 6.5cm × 10cm × 0.5cm 大小的微型凝胶就足以满足该实验。
3． 用解剖刀在琼脂糖胶上切出 0.5cm × 1cm 的小孔并用 1 × TBE 灌满。
4． 用一张 0.5cm × 0.5cm 的 NA45 膜放在每个小孔中并保证这膜延伸到阳极。
5． 用镊子将聚丙烯酰胺凝胶的小胶块放在每个孔中，可稍折小条块，使其放入孔中。用电压梯度使 DNA 能迁移到 DNA45 膜上，在 1 × TBE 缓冲液中进行电泳，在洗脱过程中， DNA 的迁移完后即可关闭电源，将小胶块用镊子移去，用盖革计数器来检测。
6． 用镊子将膜转移至微量离心管中，每个管中加 100 ～ 200 μ l 洗脱缓冲液，确保每片膜能完全浸泡在缓冲液内。
7． 68 ℃温育 30 ～ 60 分钟。
8． 将洗脱液转移入新管中，加等体积苯酚 / 氯仿（ 1 ： 1 ），剧烈振荡。
9． 室温下离心 5 分钟相，将上层液相转至新管中。
10． 每管加入 5 μ g 经超声波处理的鲑精 DNA ，再加入 2 倍体积 100 ％乙醇，在－ 80 ℃下放置 10 分钟以沉淀 DNA 。
11． 4 ℃离心收集 15 分钟沉淀 DNA 。
12． 用巴斯德吸管吸去上清，用盖革计数器检测标记 DNA 。
13． 用 80 ％乙醇 500 μ l 清洗沉淀小块，振荡、 4 ℃下离心 5 分钟。
14． 弃去上清，用干燥器或真空离心蒸发浓缩器干燥沉淀。
DNA 片段的切割和变性 PAGE 分析
l 变性聚丙烯酰胺凝胶（测序用）的制备
1． 清洗并硅化两块玻璃板（ 33cm × 42cm 和 33cm × 39cm ），然后用 100 ％乙醇轻擦表面后，将两块玻璃板的池用 0.2mm 厚的垫条隔开，组装好玻璃板。
2． 加 10 ％ APS 200 μ l 和 TEMED 200 μ l 至 100ml 变性胶贮液中，混合后立即灌入已准备好的玻璃间，插入梳子，让胶聚合 1 ～ 2 小时。
3． 拔去梳子将玻璃板装在电泳槽中，用 1 × TBE 加在上下槽内，用巴斯德吸管以 1 × TBE 冲洗加样孔，在 40 ～ 50W 下预电泳 1 小时。上样前使胶预热是非常重要的。
l 切割反应
1． 在每一干燥的 DNA 沉淀中（即样品 1 ～ 4 ）加入 10 ％哌叮 100 μ l 。
2． 90 ℃温育 30 分钟。
3． 用针在每个离心管盖子上刺一个小孔，将冷冻干燥已切割的 DNA 样品在真空离心蒸发浓缩器中 2 ～ 5 小时或直至完全干燥。
4． 用闪烁计数确定每一 DNA 样品的契仑科夫辐射量。
5． 将测序染液加到 DNA 样品中，使 1 ～ 3 号样品的终浓度为 5000cpm/ μ l ，而 4 号应为 104 cpm/ μ l 。
6． 100 ℃处理 10 分钟使 DNA 变性，然后置于冰上冷却。
7． 向 40 ～ 50W 预热 1 小时的变性聚丙烯酰胺凝胶的加样孔内上样，每个样品上 5 μ l 。
8． 根据 DNA 片段的长度， 40 ～ 50W 下电泳 2 ～ 3 小时。
9． 从电泳槽上取出玻璃板，去掉垫条使凝胶附在其中一块玻板上，小心地将一块 Whatman 3MM 纸板放在胶上，慢慢剥下纸板使胶附于其上，用 Saran 膜覆盖凝胶， 80 ℃干燥 1 小时。对干燥的凝胶用 X 光片在－ 80 ℃下曝光过夜，以显示 DNA 条带。
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