特异性位点的DNA甲基化的检测方法

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1 甲基化敏感性限制性内切酶 (methylation-sensitive restriction Endonuclease，MS-RE)-PCR/Southern法

这种方法利用甲基化敏感性限制性内切酶 对甲基化区的不切割的特性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析。常使用的甲基化敏感的限制性内切酶有HpaⅡ-MspⅠ(识别序列CCGG)和SmaⅠ-Xmal(CCCGGG)等。由于后者识别的碱基数相对较多，其碱基序列在体内出现的概率相对较低，所以以前者即HpaⅡ-MspⅠ更常用。其中HpaⅡ和MspⅠ均能识别CCGG序列，然而当序列中的胞嘧啶发生甲基化时，HpaⅡ不切割，利用HpaⅡ-MspⅠ的这种属性处理DNA，随后进行Southern或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态]。这是一种经典的甲基化研究方法，其优点是：相对简单,成本低廉，甲基化位点明确,实验结果易解释;缺点是：1.由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因此非该序列中的CG将被忽略;2.只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态时,该检测方法的结果才有意义;3.相对而言，Southern方法较复杂，且需要样本的量大;4.存在着酶不完全消化引起的假阳性的问题;5.不适用于混合样本。

2 直接测序法

直接测序 是由Frommer等提出的研究DNA甲基化方法过程是：重亚硫酸盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶保持不变，行PCR扩增所需片段,则尿嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，最后,对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较,判断是否CpG位点发生甲基化。此方法是一种可靠性及精确度很高的方法，能明确目的片段中每一个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,过程较为繁琐、昂贵。

3 甲基化特异性的PCR (methylation-specific PCR, MS-PCR)

Herman等1996年在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。它将DNA先用重亚硫酸盐处理，这样未甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶，而甲基化的不变，随后行引物特异性的PCR。MS-PCR中设计两对引物，并要求：1.引物末端均设计至检测位点结束;2.两对引物分别只能与重亚硫酸盐处理后的序列互补配对，即一对结合处理后的甲基化DNA链，另一对结合处理后的非甲基化DNA链。检测MSP扩增产物，如果用针对处理后甲基化DNA链的引物能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化;若用针对处理后的非甲基化DNA链的引物扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化 。 DNA经重亚硫酸盐处理后，以处理后的产物作为模板，加入甲基化特异性的引物(primerⅠ)或非甲基化的引物(primerⅡ)，进行特异性的扩增，只有结合完全的甲基化或非甲基化特异性引物的片段才能扩增出产物。这种方法的优点是：1.避免了使用限制性内切酶及其后续相关问题;2.敏感性高;可用于石蜡包埋样本;缺点是：1.要预先知道待测片段DNA的序列;2.引物设计至关重要;3.若待测DNA中5-甲基胞嘧啶分布极不均衡，则检测时较为复杂;4.这种方法只能作定性研究，即只能明确是否存在甲基化;若要求定量，则需用其他的方法进行进一步检测;5.存在重亚硫酸盐处理不完全导致的假阳性。

4 甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(methylation-sensitive single nucleotide primer extension，Ms-SnuPE)

Gonzalgo and Jones 1997年提出了结合重亚硫酸盐处理和单核苷酸引物延伸(Kuppuswamy等1991年提出)的Ms-SnuPE方法，用于定量检测已知序列中特异位点的甲基化水平。过程是：先将研究序列用重亚硫酸盐处理，未甲基化的胞嘧啶全部转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不变。进行PCR扩增，然后取等量扩增产物置于2管中，分别作为Ms-SnuPE单核苷酸引物延伸的模板。设计用于Ms-SnuPE延伸的引物的3’端紧邻待测碱基。同时于2个反应体系中加入等量的Taq酶、引物、同位素标记的dCTP或dTTP。这样，如果待测位点被甲基化，则同位素标记的dCTP会在反应延伸时连于引物末端;若是未被甲基化，则标记的dTTP参与反应。末端延伸产物经电泳分离和放射活性测定后可得出C/T值，即为甲基化与非甲基化的比值，从而分析得到待测片段中CpG位点甲基化情况。同理也可以用dGTP或dATP。而且，若需研究一条链上不同位点CpG甲基化情况，可通过设计不同的引物在同一反应中完成。 DNA经重亚硫酸盐处理后，以PCR扩增后得到产物作为Ms-SnuPE延伸的模板，于反应体系中入设计好的引物和同位素标记的dCTP或dTTP进行甲基化特异的单核苷酸引物延伸，随后，电泳分离、测定同位素放射活性，确定甲基化水平。这种方法的优点：1.可以了解特异位点甲基化情况且不受内切酶的限制;2.通过设计的不同引物在同一延伸反应情况可以了解不同位点CpG甲基化的状况;3.可以检测出样本序列中分布不均匀的甲基化位点;4.是一种能够用于定量检测甲基化水平的方法;5.仅需少量的DNA样本，可以用于石蜡包埋样本的测定。缺点是：1.实验步骤略复杂，若要检测多个位点时则需设计多个引物;2.存在放射性污染及重亚硫酸盐处理不完全的问题。

5 结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)

Xiong and Peter报道了COBRA[31]甲基化检测法。这种方法对标本DNA行重亚硫酸盐处理及PCR扩增，处理后原甲基化的胞嘧啶被保留，而非甲基化的胞嘧啶变为胸腺嘧啶。随后用限制性内切酶对转化后PCR产物切割的特性以识别原标本DNA的甲基化状况。重亚硫酸盐处理DNA后行PCR扩增，用限制性内切酶(BstUI)识别转化后序列中的酶切位点，消化产物电泳分离，与完全非甲基化阴性对照组比较，得出序列中特异位点甲基化水平。

6 甲基化敏感性单链构象分析(methylation-specific single-strand conformation analysis，MS-SSCA)

甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)又称重亚硫酸盐甲基化-PCR-SSCP(Single-Strand Conformation Polymorphism，SSCP)(BiPS)，由Maekawa等1999年[32]报道。方法是：先用重亚硫酸盐处理待测片段，针对非CG二核苷酸区设计引物进行PCR扩增，扩增产物变性后作非变性的聚丙酰胺凝胶电泳，由于DNA电泳时的移动性取决于其二级结构即DNA的空间构象，而后者又由DNA碱基的序列决定。因此，经处理后变性的单链DNA将停留在聚丙酰胺膜的不同位置上，这样甲基化与非甲基化的就被分离开，随后行单链构象多态性分析加以明确： 重亚硫酸盐处理DNA后，设计引物(非CG二核苷酸区)对处理后的DNA进行扩增, 产物解链后行聚丙酰胺凝胶电泳，由于甲基化和非甲基化单链DNA形成不同的空间构象，它们在电泳中移动速率不同， 故出现在不同位置，从而判定待测片段中甲基化情况。这种方法的优点是：1.能够方便的应用于任何序列的甲基化状态分析;2.能够对甲基化的等位基因进行半定量;3.可以提示甲基化状态分布的不均匀性;缺点是：1.只有甲基化水平较高的单链才能明显的区分开，而较低水平的则不易分开，有时会因甲基化的CpG位点随机和不均匀分布导致电泳条带出现拥挤、拖尾的现象，故敏感性及准确性略低;2.检测片段不宜过长。

7 甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(methylation-specific denaturing gradient gel electrophoresis，MS-DGGE)

变性梯度凝胶电泳(DGGE)是一种能够将具有单碱基差别的DNA分离的方法。其原理是：当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性温度对应一致的位置时，DNA部分解链(解链区域的长度大小不等)，与每一个解链区域相对应的温度称为解链温度(T)。Tm主要由核苷酸的序列决定，这是因为DNA链上相邻碱基间的相互作用对稳定DNA双螺旋起重要作用。因此，很小的变化(如单碱基变化)也会引起Dundefined*段Tm值的改变。DGGE系统中，Dundefined*段在变性梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳时，由于凝胶中变性剂浓度自上而下呈梯度递增，因此，当Dundefined*段到达与该区域的T值相当的某一浓度位置时，DNA解链变为分枝状，其移动减慢，停留在凝胶的的某一位置，这样不同的Dundefined*段就被分离。mAggerholm等1999年将其用于甲基化的检测，先用重亚硫酸盐处理DNA使为甲基化的胞嘧啶转变为尿嘧啶引起点突变，这样再结合使用DGGE，经电泳分离、分析该片段的甲基化状况。这种方法的优点是：DGGE可以用来检测出除最高温度解链区域以外的所有发生甲基化的Dundefined*段，需样品量少，能较直观的显示出甲基化情况。缺点是：解链温度和DGGE的变性浓度梯度需要摸索。

这种方法的优点有：

1.方法相对简单，不需预先知道CpG位点及样本序列;

2.可以进行甲基化水平的定量研究;

3.需要样本量少，可用于石蜡包埋样本的分析。

缺点是：1.只能获得特殊酶切位点甲基化情况，因此检测阴性不能排除样品DNA中存在甲基化的可能;2.由于酶和PCR的使用，只能分析一种特定序列。

8 甲基化敏感性解链曲线分析(methylation-specific melting curve analysis，MS-MCA)

Worm等2001年报道的MS-MCA是将DNA经重亚硫酸盐处理与Lightcycle联用检测DNA序列甲基化的方法。荧光素标记双链DNA。这种方法根据检测到的荧光度对应的解链温度，判断分析研究序列中甲基化的情况。在Lightcycle过程中，随着温度升高，逐渐达到DNA双链各解链区域的解链温度Tm，DNA呈区域性逐渐解链，一般说来，序列中CG含量越高，对应的解链温度越高。由于非甲基化的胞嘧啶经重亚硫酸盐处理后变为尿嘧啶、PCR后变为胸腺嘧啶，故其所在序列中的CG含量降低，热稳定性降低，解链温度降低。而甲基化的由于其CG含量高，故其解链温度高。所作结果与标准曲线对照，根据这种特性就可以明确研究序列中CpG的分布区及甲基化程度。 这是一种能对甲基化分布不均匀的DNA样本进行半定量分析的方法。缺点是：1. 它不能够精确检测甲基化的具体位点;2.研究序列的长度不宜过长;3. 该法对低水平的DNA甲基化敏感性低[37]。

9 荧光法(Methylight)

Eads等2000年报道的荧光法利用实时PCR(Real-time PCR)测定特定位点甲基化的情况。其过程如下：先用重亚硫酸盐处理待测Dundefined*段。设计一个能与待测位点区互补的探针，探针的5'端连接报告荧光，3'端连接淬灭荧光，随后行实时定量PCR。如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸时，TaqDNA聚合酶5'到3'端的外切酶活性会将探针序列上5'端的报告荧光切下，淬灭荧光不再能对报告荧光进行抑制，这样报告荧光发光，测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化情况及水平;同理，若标记的探针未能与DNA杂交，则引物延伸不能跳过未甲基化位点，报告荧光不被切下，不发光。同样方法，也可对引物进行荧光标记，并通过不同标记的组合，检测多个位点的甲基化水平。高敏感、快速是本方法最显著的特点,它可以在非甲基化等位基因超出10000倍的情况下精确的检测到甲基化的等位基因并定量，而且可以做多样本、多基因位点的快速分析。此外其具备可重复、所需样本量少、不需要电泳分离的特点。它可以为临床标本的分子生物学研究提供可靠的技术支持。缺点是费用高，测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物，且受较多因素影响。

10 DNA微阵列法

Yan等2001年将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于DNA甲基化检测中，这种方法是基于杂交的寡核苷酸微阵列，是一种在基因组中寻找新位点的方法。包括用于整个基因组范围内扫描的差异甲基化(DMH)杂交(Huang等1999年)和用于检测某个位点的甲基化特异性微阵列MSO(Gitan等2002年)。前者类似于mRNA表达谱或cDNA微阵列，是CpG岛微阵列，后者类似于寡核苷酸微阵列，是针对CpG二核苷酸位点的甲基化特异性寡核苷酸微阵列。 MSO要求预先设计一对含有2个不相邻的GC(或AC)的探针，用于识别甲基化和非甲基化的序列，其中含GC的探针(5[42]'---GC---GC---3')识别甲基化序列，含AC的探针(5'---AC---AC---3')识别非甲基化序列，探针的5'端通过Linker固定于玻璃板上。首先对待研究片段用重亚硫酸盐处理，将非甲基化的胞嘧啶变为尿嘧啶，甲基化的不变，再行PCR扩增，产物的3'端用荧光素标记，移至连有探针的玻璃板上进行杂交，通过检测杂交后产生的荧光强度判断待测序列中甲基化的水平。此方法一定要设立对照。该法可用于多样本、多位点甲基化的检测，样本需要量少，适于临床样本，但存在假阳性问题。

11 甲基化敏感性斑点分析(methylation sensitive dot blotassay，MS-DBA)

G Clément等2005年报道了一种新的方法，能够定量或半定量分析样本中的甲基化水平。这个方法的过程是：先用重亚硫酸盐处理待测Dundefined*段，随后以非CG区的引物行PCR扩增，将扩增产物变性后转移到尼龙膜上，用3'端DIG标记的含有2个CG(或TG)的双核苷酸探针与DNA杂交，随后用带有荧光标记的抗DIG抗体与之反应。与双CG的探针获得杂交的标本含有甲基化，而与TG探针杂交的标本未被甲基化。通过比较斑点上荧光的强度测定甲基化水平。这种方法的优点是快速、简便、易于掌握，可一次检测多种样本，包括石蜡包埋样本。缺点是：1. 检测序列不能过长;2. 若探针错误杂交或重亚硫酸盐处理不完全，则可能出现假阳性或假阴性结果。

12 甲基化特异性多连接依赖性探针扩(Methylation-Specific multiplex ligation-dependent probe amplification，MS-MLPA)

Anders O.H.等2005年改进MLPA为MS-MLPA用于检测特异位点的甲基化。MS-MLPA中，针对甲基化的和非甲基化的位点分别设计两个探针，每个探针都包括两个寡核苷酸部分，其中短的部分由合成产生，长的部分来源于phageM13的衍生物，后者有一个非杂交填充片段，不同探针其长度不同。探针的两个寡核苷酸杂交序列均与目标序列互补，其末端都连有相同的PCR引物。且要求设计的MS-MLPA的探针要有甲基化敏感的限制性内切酶HhaⅠ(GCGC)或HpaⅡ(CCGG)的识别位点,这样，经探针和目标序列杂交后，降低反应体系温度，并向其中加入连接酶HhaⅠ，若原样本DNA中含有HhaⅠ识别的非甲基化的位点，则非甲基化探针的两个寡核苷酸部分不能连接，而甲基化的探针顺利连接不被切割，在随后的PCR反应中只有两个寡核苷酸部分连接后的探针才能被扩增。最后分析扩增片段，确定待研究位点的甲基化情况：用设计好的甲基化与非甲基化的探针(探针各寡核苷酸部分含有杂交序列，不同探针其填充片段的长短不同)分别与待测DNA杂交，结合上的寡核苷酸探针经连接酶连接，若Dundefined*段中存在甲基化位点，则带有(HhaⅠ)识别位点的探针不能被切割，同理，若为非甲基化，则Dundefined*段被HhaⅠ切开，且探针不能被连接，这样，在随后的PCR扩增过程中，只有连接的探针能被扩增，最后对扩增的片段进行分析，得出原DNA中特异位点甲基化的情况 。这种方法的优点是：1.需要样本的数量少，由于探针具有非常短的识别序列，因此MPLA可以用于局部降解的DNA，如从石蜡包埋的DNA样本;2.可用于分析大量混合样本。缺点是探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制，且要考虑到所用酶的反应适宜温度。

13 甲基化敏感性高分辨率溶解曲线分析(methylation-sensitive high-resolution melting analysis)

HRM技术这是近几年国内外兴起的一项高新技术，基于此技术Tomasz K Wojdacz等开发了MS-HRM技术，基本原理同MS-MCA的方法，针对甲基化区域附近设计引物，将修饰后的DNA做PCR，再进行低温到高温的溶解的过程，参照标准曲线，即可对样本做定性和定量的分析，如下图所示。其优点：操作简便、高灵敏度、高通量、成本低。缺点:对仪器的要求较高，需使用带有HRM模块的荧光定量PCR仪