差减cDNA文库法
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差减 cDNA 文库法
[ 第一条链 cDNA 合成 ]
1. 合成第一条 cDNA 链时,所有试剂应按下列顺序依次加入:
10 ×第一条链合成缓冲液 5.0 μ l
10mM dNTP Mix(1.4 μ g/ μ l) 2.5 μ l( 终浓度 1.25mM)
Linker primer(1.4 μ l ,终浓度 100 μ g/ μ l)
DEPc H2 O
RNase block Ⅱ (1U/ μ l) 1.0
mRNA 1~5 μ g
混合,离心 20 秒钟,室温放置 10 分钟
2. 加入逆转录酶至 1500U/ml ,补水到终体积 50 μ l 。
3. 混合,取出 5 μ l 放入含有 0.5 μ g α -32 P dATP ( 800Ci/mM ),分别保温在 37 ℃ 1 小时。
4. 保温后,带有同位素的离心管放入 -20 ℃保存,为以后分析用。第一条链 cDNA 混合物放在冰上。
[ 第二条 cDNA 链的合成 ]
1. 对于总体积为 45 μ l 的第一条链混合物按下列次序依次加入:
第一条链混合物 45.0 μ l
10 ×第二条链缓冲液 20.0 μ l
0.1M DTT 8.0 μ l
10mM dNTP Mix 3.0 μ l
α -32 P dATP ( 800Ci/mM ) 1.0 μ l
dd H2 O 115.0 μ l
2. 混合后,加入:
RNase H (4.0U/ μ l) 1.0 μ l
DNA 聚合酶( 10.0U/ μ l ) 7.0 μ l
第二条链反应体积 200 μ l ,在 16 ℃水中保温 2.5 小时,注意水温不得超过 16 ℃,保温后立即放在冰上。
3. 反应混合物随后用酚,氯仿提取
4. 用乙醇沉淀于, -20 ℃过夜。
5. 次日,在 4 ℃,以最大速度离心 1 小时。
6. 用 80% 乙醇洗一次。
7. 冷冻干燥 cDNA 。
8. 最后沉淀物溶于 43.5 μ l 的 dd H2 O ,取出 4.5 μ l 存入冰箱,作为第二条链分析用。
[ 填补 cDNA 末端 ]
1. 在 39 μ l 的 cDNA 溶液中加入 : 5.0 μ l 的 10 × T4 DNA 聚合酶缓冲液, 2.5mM dNTP 混合物。
2. 反应物在 37 ℃保温 30 分钟。
3. 酚,氯仿提取。
4. 酒精沉淀 cDNA , -20 ℃至少沉淀 30 分钟。
5. 在台式离心机中,以最大速度 4 ℃离心 60 分钟。
6. 80% 乙醇洗涤沉淀。
7. 冷冻干燥 cDNA 沉淀。
[ 连接 ]
1. 在反应总体积 10 μ l 中,应有:
1 μ l 10 ×连接缓冲液
1 μ l 10mM ATP
1 μ l (4 Weiss U/ μ l)
T4 DNA 连接酶,连接子或者 Adapter
2. 反应在 8 ℃保温过夜。
3. 保温后,反应离心管放于 70 ℃ 30 分钟,以灭活 DNA 连接酶。
[cDNA 末端磷酸化 ]
1. 70 ℃灭活反应后,稍微离心一下,置室温 5 分钟。
2. 在反应混合物( 10 μ l )中加入:
1 μ l 10 ×连接缓冲液
2 μ l 10mM ATP
1 μ l ( 10 μ) DNA 激酶
[ 限制性内切酶消化 ] 以得到粘性末端
1. 限制性内切酶消化 DNA 和载体。
2. 在 37 ℃保温 1~5 小时,然后冷却到室温,如果选用定向插入,需用两个不同的限制性内切酶消化,可得到两个不同的粘性末端。
[cDNA 大小的选择 ]
1. 在 50 μ l 的总体积中加入 5 μ l 0 × STE 缓冲液。
2. Sephacryl S-400 柱收集分离出的 cDNA 。
3. 用酚,氯仿抽提。
4. 酒精沉淀之后,悬浮 cDNA 在 10 μ l 的无菌水中。
[cDNA 和载体连接 ] 载体可用λ gt10, λ gt11 或λ ZAP Ⅱ
cDNA (0.1~1 μ g) 2.5 μ l
10 ×连接缓冲液 0.5 μ l
10mM α ATP 0.5 μ l
载体( 1 μ g/ μ l ) 1.0 μ l
T4 DNA 连接酶( 4 Weiss U/ μ l ) 0.5 μ l
总体积为 5 μ l
12 ℃保温过夜,或 4 ℃两天,然后放在室温下 2 小时。
[ 包装 ] 试剂由 Strategene 制备
1. 包装提取物从 -70 ℃取出立即放入干冰中。
2. 同时化解超声提取物(黄色)。令在手指间溶解冻红色管,到刚刚开始化时,加 1 μ lDNA 置于冰上。
3. 快速加 15 μ l 超声提取物到 DNA 中,仔细混合,避免气泡,在室温下保温 2 小时( 22 ℃)。
4. 加 500 μ l 噬斑稀释缓冲液( SM 溶液),再加 20 μ l 氯仿,温和的混合。
5. 离心弃去噬菌体碎片。这个 cDNA 文库可以测效价,保存于 4 ℃中。
[ 制备 ZAP Ⅱ文库的单链 cDNA]
1. 在一个 50ml 的圆锥形离心管中,加宿主菌 250 μ l 到 SM 液中:
SM 液: 20mM Tris pH7.5
100nm NaCl
10nM MgSO4
0.2% Gelatin
2. 37 ℃保温 15 分钟后,加 5ml 2 × YT (其中每升溶液含 10g NaCl, 10g 酵母提取物, 16g 胰酶解胨), 37 ℃摇 5 小时。
3. 然后在 70 ℃保温 20 分钟。
4. 4000g 离心 5 分钟,以除去细菌裂解碎片。回收上清液。这里应含有诱导得到的单链重组噬菌体,同样还会有辅助噬菌体。滴度可以按细菌的形成单位来计算。
[ 大量制备生产单链噬菌体 DNA]
1. 新鲜过夜培养的宿主菌 XLI-Blue ,以 1 : 20 稀释在 LB 培养液中,在 37 ℃培养扩增 2 小时。
2. 加 1ml 含单链 cDNA 的上清液。
3. 再于 37 ℃继续培养 2 小时。
4. 然后将全部溶液转到 500~1000ml LB 中,生长 5~6 小时。
5. 9500 rpm 离心 60 分钟,除去细菌碎片。
6. 向上清液中加等体积的 20% PEG , 3.5M 醋酸胺溶液,室温下沉淀 30 分钟。
7. 9500 rpm 离心 45 分钟,把 PEG 沉淀悬浮在含有 405mg/ml 的 SM 溶液中, 23 ℃ 35 000rpm 离心 16~24 小时,在管上部附近,噬菌斑会形成一个可见带,针刺法收集可见带,并对 SM 溶液透析,最后以酚、氯仿抽提,酒精沉淀噬菌体 DNA 。
[ 生物素标记 ]
1. 取来自一个文库的单链 cDNA ,先用生物素标记后,再与另一个不加生物素标记的 cDNA 以 10 : 1 进行杂交。
2. 生物素标记物来自 Vector Laboratories ,取 100 μ g 的单链 DNA 溶解在 HE 缓冲液中, HE 缓冲液为: 10mM HEPES pH7.5, 1M EDTA.
3. 100 μ g/ml 超声粉碎。
4. 酒精沉淀,溶解在 100 μ lHE 缓冲液中。
5. DNA 与 100 μ l 重组的 Photoprobe 生物素充分混合。
6. 然后暴露在 275W 的太阳灯下 15 分钟,混合物与照射距离灯 10cm ,再重复一次,共 30 分钟。
7. 混合物用正丁醇抽提 4 次。
8. 乙醇沉淀,沉淀物再悬浮于 100 μ l HE 缓冲液中。
[ 差减杂交 ]
1. 100 μ g 的生物素标记的单链 cDNA 与另一个文库的 10 μ g 的未经生物素标记的单链 cDNA 乙醇共沉淀。
2. 加入: 5 μ g Poly A(Pharmacia), 5 μ g Poly C(Pharmacia) ,溶解在 10 μ l HE 缓冲液中。
3. 把这 10 μ l 混合物加到 10 μ l 杂交混合物中,此杂交混合物含有:
1.5m NaCl
50mM HEPES pH7.5
10mM EDTA
0.2% SDS
总共 20 μ l
4. 把样品紧紧地封在一个硅化过的 0.75 μ l 的微量离心管中。
5. 煮沸 1 分钟后。
6. 浸在 68 ℃水中 20 小时。
7. 杂交后的差减物用 Streptavidin-Phenol 提取除去杂交的 DNA 。
8. 用乙醇沉淀后再悬浮于 20 μ l 2mM Tris pH7.5+0.1 M EDTA 溶液中。
9. 取 5 μ l 单链 cDNA ,加:
5pmole 的引物 1 μ l
引物粘合缓冲液( 20mM Tris pH7.5, 50mM NaCl ) 2 μ l
H2 O 2 μ l
总体积为 10 μ l
10. 68 ℃保温 10 分钟,使引物和 cDNA 粘合,再慢慢冷却至低于 30 ℃,大约需要 2 小时。
11. 10 μ l 的体积稀释到 50 μ l 的反应缓冲液中,反应缓冲液组成为: 10mM Tris pH7.5, 7mM MgCl2 , 1mM DTT, 50mM dNTP 。
12. 加 10 单位的 Klenow 聚合酶, 37 ℃保温 2 小时。
13. 反应物用于转化大肠杆菌。转化用 LB 琼脂糖平板,琼脂平板含有: 50 μ g/ml 青霉素, 50 μ l 2% 的 X-gal , 100 μ l 0.1M IPTG 。
14. 用无菌牙签挑出所有白色菌落,于 96 孔板中,每孔中含有 100 μ l LB 培养液并含有 100 μ g/ml 青霉素。
15. 把 96 孔板用石蜡膜包好,在 37 ℃摇动过夜。
16. 第二天,在每孔中加入 100 μ l 高压效度过的 50% 甘油,再回 37 ℃摇动 1 小时, 96 孔板保存在 -80 ℃冷冻箱,稳定 1~2 年,这就是差减后的 cDNA 文库。