差减杂交法

差减杂交法是目前广泛应用于差异性基因分离和鉴定的方法之一。简单地讲，差减杂交法是基于不同样品间特定核酸序列 ( 基因组 DNA 或 mRNA) 在数量 ( 等位基因数目或拷贝数或表达量 ) 上的差异，通过分子间的同源性杂交将存在数量差异性的序列分离出来。

从研究对象和使用的基本材料来看，大致可以分为两类，即基因组差减杂交法和 mRNA 或 cDNA 差减杂交法。

1 ．原理

就是将不同来源的基因组DNA 用特定的限制性内切酶进行消化( 通常使用识别四位点的酶切，这样可以酶切得更完全和形成相对短的片段以利于完全的杂交反应) ，其中一种样品来源的DNA 过量并进行生物素标记。

将两种样品混合杂交，一起变性和复性，然后通过生物素和亲和素亲和性结合的特点，去除生物素标记样品来源的DNA 以及杂交双链，剩余的DNA 中加人新的过量的并标记的异源DNA 样品，重复进行几次杂交反应。

达到最大限度地驱除两者共有序列的目的，最后得到的单一样品来源的双链DNA ，并通过特异性的酶切末端连入适当的载体构建差减文库，进行进一步的鉴定。

鉴定的方法包括以标记的不同样品来源的原始DNA 为探针，对差减文库进行菌落原位杂交或斑点杂交，或者以差减文库的DNA 片段作为探针，对不同样品来源的原始DNA 进行Southern 杂交或细胞和组织原位杂交，然后进行序列分析。

2．特点

在形态学检查中不能分辨的染色体或DNA变异性，通过控制杂交条件，可以分离出那些存在细微变化的染色体片段或基因序列。本方法的缺点是工作量大，技术要求高，同时需要大量的DNA样品，对于取材困难和来源少的一些病理组织，对实验设计和实际操作的要求就更高一些。

经过不断的改进和其他新方法的引人，基因组差减杂交法将会越来越成熟并得到更广泛的应用。新方法包括mRNA或cDNA差减杂交法、基于PCR反应的差减杂交法或抑制性差减杂交（SSH）、基因或表达序列文库（cDNA or EST Libraries）杂交等。

3．应用

基因组差减杂交法使用基因组DNA作为研究对象和实验材料，主要应用于肿瘤特异性缺失片段的筛选和各种遗传性疾病的家系研究以及进化生物学的研究；

mRNA或cDNA差减杂交法则以基因转录产物mRNA或其逆转录产物cDNA作为研究对象和实验材料，是最早开发和应用于基因表达差异分析的经典方法之一，己经和正在广泛应用于包括生物学和医学的各个领域。