PCR技术应用七：地中海贫血
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地中海贫血是由组成珠蛋白的X珠蛋白链和B珠蛋白链基因突变的引起，它包括X 地中海贫血和B地中海贫血，世界疾病在我国南方各省区的发病率相当高，个别地区 可达18%，它的严重的影响人口的质量.
一、地中海贫血的临床
(一)X地中海贫血的临床:X地中海贫血在临床上可分为四 种类型①HbBarst胎儿水肿综合征②HbH病③轻型(标记型)X地中贫血及④静止型地中 海贫血.(二)B地贫在临床上亦分为四型①重型B地中海贫血，②轻型B地中海贫血③中 间型地中海贫血及④遗传性胎儿Hb持续存在症.其中第④类型较为常见.
二、地中海贫血的遗传学
(一)α地中海贫血:α地中海贫血的发生是由于α珠蛋 白链基因突变的结果，α珠蛋白是基因定位于16P16-4er)，每条染色体上均有两个α 珠蛋白基因，该基因其长30Kb其中包括有两个假基因和一个胚胎性Hb链基因，每个α 基因含有两个内含子和3个外显子总长约0.5Kb.(二)β地中海贫血:β地中海贫血由β 珠蛋白链基因突变所引起，该基因定位于11P15.5，总长度约70Kb，其中有许多胚胎性基因及假基因，而β珠蛋白基因有两个内含子和3个外显子，总长约为1.126Kb.
三、α和β珠蛋白基因的突变类型
(一)α-基因的突变:在α-基因的突变中，以 缺失型突变最为常见，其缺失的范围可从两个α-基因均缺失至一些小片段的缺失均 可在人群中检出，α-基因的另一突变即为单碱基置换，目前已发现的突变有18种以 上，它包括错义突变，无意突变剪接部位突变及起始信号突变.(二)β-基因的突变: β-基因的突变以点突变为主，即单核苷酸置换是β-基因的主要突变类型，它亦有碱基的括入和缺失，在我国检出的β-基因点突变见下表:
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位置
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性质
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对基因功能影响
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类型
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| 启动子区<font>(TATA)</font> |
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| <font>-32</font> | <font>C</font> →<font>A</font> |
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| <font>-30</font> | <font>T</font> →<font>C</font> | <font>mRNA</font> 转录效率下降 |
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| <font>-29</font> | <font>A</font> →<font>G</font> | β链合成减少 |
β＋
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| <font>-28</font> | <font>A</font> →<font>G</font> |
|
|
| <font>RNA</font> 剪接基因突变 |
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||
| <font>IVS-1n</font> ＋<font>1</font> | <font>G</font> →<font>T</font> |
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| <font>IVS-1n</font> ＋<font>5</font> | <font>G</font> →<font>C</font> | <font>mRNA</font> 合成异常 |
β＋
|
| <font>IVS-13</font> | <font>T</font> →<font>G</font> |
|
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| <font>IVS-2n</font> ＋<font>654</font> | <font>C</font> →<font>T</font> |
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| 误义突变 |
|
||
| <font>CD26</font> | <font>G</font> →<font>A</font> |
正
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| 无意突变 |
|
||
| <font>CDn</font> | <font>A</font> →<font>T</font> | β链合成短 |
β
|
| <font>CD43</font> | <font>G</font> →<font>T</font> |
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| 突变 |
|
||
| 缺失<font>:</font> | <font>CD8―AA</font> |
|
|
| <font>CD31―C</font> |
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| <font>CD41/42-TCTT</font> |
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||
| 括入 | ＋<font>40</font> ±<font>43-AAAC</font> |
|
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| <font>CD14/15</font> ＋<font>G</font> |
|
||
| <font>CD27/28</font> ＋<font>C</font> |
|
||
| <font>CD71/72</font> ＋<font>T</font> ，＋<font>A</font> |
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| 起始裂解 |
|
||
| <font>ATG</font> →<font>AGG</font> |
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四、PCR技术在α地贫基因诊断中的应用
α地贫是由α珠蛋白基因不同范围的缺 失及点突变所致，但以缺失型突变最为常见，因此，α地贫PCR诊断的主要任务就在于快速检出α珠蛋白基因的缺失片段.
(一)α基因全部缺失(--1--)的PCR诊断
α基因全部缺失所引起的临床表现为HbBar+胎儿水肿综合征，用PCR方法检测等，其反应体系组成如下:
<font> 引物:</font>
PC01；5'TACTGTAGATACCCGTGTACAA3'
PC02；5'ATCARGGAAACATAGTAAT3'
PC03；5'ACACAACTGTGTTACCTAGC3'
PC04；5'CAACTTCATCCACGTTCACC3'
扩增片段：αPC01-PC02；136；-
βPC03-PC04；110；110
扩增条件：93℃(30'')；45℃(30'')；65℃
<font> 检测：</font> 3%珠脂糖电泳
<font> 注</font> ):PCO3和PCO4扩增片段位于β基因，作为内对照.
结果判定:在正常人PCO1-PCO2扩增片段为B6bp，PCO3-PCO4为110bp，而HbBart胎儿水肿综合征仅有PC)3-PCO4的110扩增片段而无PCO1和PCO2的136bp扩增产物.
(二)部分α基因缺失型的PCR检测
除HbBart胎儿水肿外，在α地贫中，尚有部分α基因缺失的类型，它仍是α地贫2，α地贫HbH病，应用PCO1和PCO2时正常和缺失染色体均有扩增，因此对2，2，HbH及正常个体不能鉴别，因此又有人设计了一组新的引物体系进行α基因缺失的检测，该本系的组成及操作过程如下
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引物名称
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序列位置
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<font>S1</font>
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<font>F5'GTGTTCTCAGTAT<br /> TGGAGGGAA3'</font> | <font>4 S1 3'</font> 端 |
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<font>S2</font>
|
<font>F5'GACACGCTTCCA<br /> ATACGCTTA3'</font> | α<font>3'HVR 5'</font> 端 |
|
<font>S3</font>
|
<font>R5'CTACTGCAGCCT<br /> TGAACTCC3'</font> | <font>4</font> α<font>2 5'</font> 端 |
|
α<font>1</font>
|
<font>F5'CGGGCCTGGGCC<br /> CTCGGCCC3'</font> | |
|
|
<font>R5'CCACGGGGGTAC<br /> GGGTGCAG3'</font> | 二者的<font>3'</font> 端 |
|
α<font>2</font>
|
<font>F5'CGGCTGCGGGCC<br /> TGGGCCGC3'</font> | |
|
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<font>R5'ATTCCGGGACA<br /> GAGAGAACC3'</font> |
五、PCR技术在β地贫基因诊断中的应用
β地贫的基因突变主要是单碱置换.目前在世界范围内发现的单碱基置换达160余种，其中在中国发现的有21种，由于β珠蛋白基因的突变主要为单碱基碱置换，因此其诊断途径与β地贫完全不同，其诊断的主要目的即检出点突变.
(一)检测已知突变位点
<font> 1.PCR-ASD与ROB</font>
PCR-ASO是快速简便的检测已知β珠蛋白基因点突变的方法，主是利用PCR技术扩增靶基因的适当片段，然后用人工合成的含突变位点的标记寡核苷酸探针，逐一筛查，泛检测的反应体系包括.
<font> 引物</font> :见下表
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引物名称
|
位置
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序列
|
扩增片段大
小<font>bp</font> |
|
β<font>A</font>
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<font>-129--104</font> | <font>A5'GTACGGCTGTCATC<br /> ACTTAGACCTCA3'</font> | <font>A</font> →<font>B600</font> |
|
β<font>B</font>
|
编码<font>97-89</font> | <font>B5'TGCAGCTTGTCACA<br /> GTGCAGCTCACT3'</font> | <font>C</font> →<font>D422</font> |
|
β<font>C</font>
|
<font>EVS-2475-476</font> | <font>C5'GTGTACACATATTG<br /> ACCAAA3'</font> | <font>A</font> →<font>D1502</font> |
|
β<font>D</font>
|
编码<font>114</font> →<font>108</font> | <font>D5'AGCACACAGACCA<br /> GCACGTT3'</font> | <font>41</font> |
点膜与杂交<font>:PCR-ASO</font> 是将<font>PCR</font> 扩增产物点于杂交膜上，然后与上述的<font>ASO</font> 探针杂交，根据杂交的结果判断分析，以确定突变位点<font>RDB</font> 以改传统的杂交途径，它是将一系列的标记<font>ASO</font> 探针固定在膜上，然后用之与<font>PCR</font> 扩增产物进行杂交，使检测程序大大简化<font>.</font>
张是增等人根据我国常见的β基因突变情况，将<font>18</font> 种<font>5</font> 突变分为两组，一组为常见的，另一组为非常见，与这些突变相对应的<font>ASO</font> 探针反分为两组，将这些探针固定于膜上，再与相反的<font>PCR</font> 扩增产物进行杂交，常用的<font>7</font> 种<font>ASO</font> 探针可检出<font>98%</font> 的中国人β基因点突变同<font>RDB</font> 方法简便，快速，使用非同项素标记的<font>ASO</font> 探针使之节约于推广，而是探针膜条便于保存和运选<font>.</font>
<font> 2.</font> <font>等位特异</font> <font>PCR(ASAPCR)</font>
<font> ASAPCR</font> 是检测已知β基因突变优点进行β地贫基因诊断又一有效手段，有人用该方法检测<font>Cordows41-42</font> ，<font>TVSnt654</font> ，<font>CD17TATA</font> 盒<font>-28</font> 和<font>CD71-72</font> ，这五种我国南方常见的β基因点突变诊断β地贫，完成的用于产前诊断<font>.</font>
<font> 3.PCR-RFLP</font> <font>检测</font> 引起内切酶切点改变的突变诊断β地贫<font>.</font>
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突变位置
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内切酶
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切点影响
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β
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<font>Mnl</font> Ⅰ
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丢失
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<font>CD17</font>
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<font>Mae</font> Ⅰ
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生成
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<font>-29</font>
|
<font>NIa</font> Ⅲ
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生成
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<font>CD43</font>
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<font>Hinf</font> Ⅰ
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消失
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<font>TVS-1nt1</font>
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<font>BsPM</font> Ⅰ
|
消失
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<font>CD41-42</font>
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<font>HinFZ</font>
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酶解产物变化
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(二)突变性质不明β地贫的诊断
在β地贫中，尚有一部分人群的基因突变性质不明，但临床表现为β地贫则可用PCR-SSCP、PCR-DGGE、PCR-TGGG进行突变片段筛查，然后对异常的片段进行快速测定，以确定突变位置性质及β地贫的关系.
