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PCR技术应用九:检测人COX病毒

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  柯萨奇病毒(Coxsackie viruses简称Cox.病毒)是1948年Dalldorf等采用新生小鼠研究脊髓灰质炎病毒时,在纽约附近的Coxsackie分离发现的一种肠道病毒,属小RNA病毒科,可分为A、B二组.A组有23型(A1-22,24),B组有6型(B1-6),与A组的A9型有共同的组特异性抗原.Cox病毒可引起许多不同的临床症侯,甚至同一病毒可以引起不同的疾病(表1),近年通过PCR技术证明,除可导致脑炎、脑膜炎外,是心肌炎、心包炎的重要病原,其持续感染可能与特发性扩张型心肌病密切相关.本文简述PCR技术在Cox病毒检测中的应用.

一、Cox病毒基因与PCR引物设计

  Cox病毒为肠道病毒属,其基因结构具有小RNA病毒科的共同特征(如图所示),可分为衣壳蛋白基因区,无性繁殖功能区和非编码区,其5'-末端即位于衣壳蛋白基因外的碱基序列同其他小RNA病毒具有较高的交叉性.

病毒感染引起的主要临床症侯

主要临床症侯
主要型别
无菌性脑膜炎
A
24-79101216
 
B
所有型别
疱疹性咽峡炎
A
1-68-10162122
急性上感
A
2102124
 
B
2-5
手口足病
A
16
流行性胸痛
A
468-10
 
B
1-5
心肌炎
B
2-5
心包炎
B
1-5
麻痹疾病
A
479
 
B
3-5

  目前,根据Cox 病毒基因的序列研究结果,人们选择高度保守的编码区和 5' 非编码区(nts461-640) ,已设计了多对引物,用于Cox 病毒A 组和B 组的扩增及特异性扩增CoxB3 病毒. 但由于Cox 病毒与其小RNA 病毒基因之间有高度的同源性(70-90% ,位于VP1 基因) ,目前设计的引物除CoxB3 病毒特异性引物外,其余的引物均可用于扩增CoxA 组和B 组病毒,并同脊髓灰质炎病毒有较高的交叉反应.

Cox病毒PCR扩增所用引物及探针

引物及
序列
位置
片段
意义
探针
(5'-3') ( 核苷酸)
(bp)
 
P1()
CGGTACCTTTGTGCGCCTGT 64-83
414
用于扩增CoxA16 21
P2()
TTAGGATTAGCCGCATTCAG 459-478
 
CoxB1-6
探针
TATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGG 430-455
 
 
P3()
CAACTTAGGAGAAAGCTAGA 2745-2764
147
CoxB3 特异性引物
P4()
CACCTGGTGGTACATACATA 2873-2892
 
 
探针
CGGTTCGACCTGGAGCTGAC 2781-2800
 
 
P5()
GCAACTCCCATCACCTGTAC 6718-6737
186
CoxB2-4PV1
P6()
ATCACATCATCAACCATATGC 6885-6904
 
 
探针
TACTTTGTGAGGGGTGGCAT 6750-6769
 
 
P7()
TATGGTGATGATGTGATCGC 6889-6908
300
同上
P8()
TCCCCGTTATGCCAAGCTAA 7170-7189
 
 
探针
TTGGATCCTTGGTCCATCTA 7115-7134
 
 
P9()
TGCGGCTAATCCTAACTGCG 461-480
179
同上
P10()
CCGGATGGCCAATCCAATA 621-640
 
 
探针
CGGTTCCGCTGCAGAGTTGC 522-541
 
 

二、标本的采集和处理

  按常规方法收集鼻咽分泌物、粪便、心肌活检材料及脑脊髓液等标本后,应在0-4℃条件下立即送实验室,分装保存于-20℃或提取模板.由于体液和组织中RNase含量较高,影响制备病毒RNA,故在制备RNA前应按100Ul标本中加40U的RNase酶抑制RNasin.

三、模板RNA制备

  1.酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿法:适用于从心肌等活检标本或细胞培养标本.①先将标本(1.5mm3)或1×107 细胞研磨匀浆,加入1ml裂解液(4mol/L异硫氰酸胍-25mmol/L柠檬酸钠PH7.0,50mmol/L2-硫基乙醇,0.5%Sarkosyl),混合后冰浴中作用15min.②分别加入1/10体积的2mol/L NaAc(PH4.0),等体积饱和酚,2/10体积的氯仿,混合作用15S.③15000r/min离心15min,收集水相,加入等体积的异丙醇,1-20℃2h,再次离心,用75%乙醇洗一次,收集RNA沉淀.

  2.酚-氯仿抽提法:适用于从体液标本中制备RNA.①取体液标本100 Ul于反应管中加入2%,使终浓度为0.5%,再与等体积的酚:氯仿(1∶1)混交,15000g离心15min,收集上层水相.②再向原反应管的有机中加入含0.5%SDS的TNE溶液(10mmol/L Tris-HCL PH7.5,100mmol/L NaCl,1mmol/L EDTA),提取一次,同上离心,收集水相.③将两次收集的水相合并,加入NH4 AC溶液,使以浓度为2mol/L,加2.5倍体积的冷无水乙醇,-20℃置2h以上,15000g离心(4℃)30min,弃上清,收集沉淀,用20UlTE(PH7.5)稀释(含40U的RNasin).

四、逆转录

  取5Ul RNA提取模板加入20Ul反应混合液(含50mmol/L Tris-HCl PH8.4,6mmol/LMgcl2 ,10mmol/L DTT,50mmol/L NaCl,250mmol/L的dATP,dCTP、dGTP、dTTP,1umol/L下游引物P2)及40U AMV逆转录酶;再加25-50Ul矿物油封顶后于42℃反应1h,使RNA逆转录为cDNA.

五、PCR扩增

  ①取上述逆转录后的反应混合物20Ul,加PCR反应液至100Ul反应体积.PCR反应液含有终浓度为50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl PH8.4,1mmol/L MgCl2 ,100Ug明胶,引物1和引物各1U mol/L及四种dNTP各200U mol/L.

  ②混匀后,94℃水溶5min,冷至55℃.

  ③加入2.5U Taq聚合酶,振荡摇匀,用100 ul矿物油封顶.

  ④94℃变性2min,55℃退火2min,72℃延伸2min,重复35个循环.最后于72℃延伸10min.

  ⑤为提高某些标本检测的敏感性,可取第一次扩增产物1Ul,作模板,加入PCR试剂进行第二次扩增(20-25个循环).

六、扩增产物的检测

  (一)电泳法:取10Ul的PCR产物于1%或2%琼脂糖凝胶上电泳,以EB染色显示PCR产物,如出现与目的片段大小相同的扩增产物,则判为阳性.

  (二)杂交法:

  1.将PCR产物与等体积的0.6mol/L NaOH混合,室温作用15min后,转移到尼龙膜上.

  2.用100Ul 2mol/L,NH4 AC溶液中和后,将滤膜置真空炉中烘烤2h.

  3.将膜置于5XSSC-1%SDS-0.5%BSA的缓冲液作预杂交.

  4.再于含50U l0.4Umol/L碱性磷酸酶标记探针的预杂交液中,45℃,15min.

  5.用1%SDS-1×SSC液及1%TritonX-100液100ml,先后各洗2次,再用1×SSC洗1次.

  6.将滤膜浸入7.5ml碱性磷酸酶混合物中室温显色3-4h,然后双蒸水洗涤,终止反应.

七、应用和发展

  目前,应用上述引物,可进行Cox病毒感染的诊断,特别是用CoxB3病毒的特异引物,扩增病人心肌活检标本中该病毒的核酸,具有很高的敏感性和特异性,同其他Cox病毒及小RNA病毒无交叉反应,并证明CoxB3是心肌炎的重要病原,同原发性扩张型心肌病密切相关,故随着此技术的深入应用,将有助于揭示上述心脏病的真正病因.当然,目前PCR引物的设计还需进一步解决Cox病毒A组、B组特异性引物及型特异性引物问题,这样才能进一步用于临床诊断及分子流行病学的研究,同时也有助于了解Cox病毒变异的规律,为研制预防用的疫苗奠定基础.

 

 

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