PCR技术应用九：检测人COX病毒
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柯萨奇病毒(Coxsackie viruses简称Cox.病毒)是1948年Dalldorf等采用新生小鼠研究脊髓灰质炎病毒时，在纽约附近的Coxsackie分离发现的一种肠道病毒，属小RNA病毒科，可分为A、B二组.A组有23型(A1-22，24)，B组有6型(B1-6)，与A组的A9型有共同的组特异性抗原.Cox病毒可引起许多不同的临床症侯，甚至同一病毒可以引起不同的疾病(表1)，近年通过PCR技术证明，除可导致脑炎、脑膜炎外，是心肌炎、心包炎的重要病原，其持续感染可能与特发性扩张型心肌病密切相关.本文简述PCR技术在Cox病毒检测中的应用.
一、Cox病毒基因与PCR引物设计
Cox病毒为肠道病毒属，其基因结构具有小RNA病毒科的共同特征(如图所示)，可分为衣壳蛋白基因区，无性繁殖功能区和非编码区，其5'-末端即位于衣壳蛋白基因外的碱基序列同其他小RNA病毒具有较高的交叉性.
<font>病毒感染引起的主要临床症侯</font>
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主要临床症侯
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组
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主要型别
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无菌性脑膜炎
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<font>A</font>
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<font>2</font> ，<font>4-7</font> ，<font>9</font> ，<font>10</font> ，<font>12</font> ，<font>16</font> |
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<font>B</font>
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所有型别 |
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疱疹性咽峡炎
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<font>A</font>
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<font>1-6</font> ，<font>8-10</font> ，<font>16</font> ，<font>21</font> ，<font>22</font> |
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急性上感
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<font>A</font>
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<font>2</font> ，<font>10</font> ，<font>21</font> ，<font>24</font> |
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<font>B</font>
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<font>2-5</font> |
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手口足病
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<font>A</font>
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<font>16</font> |
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流行性胸痛
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<font>A</font>
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<font>4</font> ，<font>6</font> ，<font>8-10</font> |
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<font>B</font>
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<font>1-5</font> |
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心肌炎
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<font>B</font>
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<font>2-5</font> |
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心包炎
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<font>B</font>
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<font>1-5</font> |
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麻痹疾病
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<font>A</font>
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<font>4</font> ，<font>7</font> ，<font>9</font> |
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<font>B</font>
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<font>3-5</font> |
目前，根据<font>Cox</font> <font>病毒基因的序列研究结果，人们选择高度保守的编码区和</font> <font>5'</font> 非编码区<font>(</font> 如<font>nts461-640)</font> ，已设计了多对引物，用于<font>Cox</font> 病毒<font>A</font> 组和<font>B</font> 组的扩增及特异性扩增<font>CoxB3</font> 病毒<font>.</font> 但由于<font>Cox</font> 病毒与其小<font>RNA</font> 病毒基因之间有高度的同源性<font>(70-90%</font> ，位于<font>VP1</font> 基因<font>)</font> ，目前设计的引物除<font>CoxB3</font> 病毒特异性引物外，其余的引物均可用于扩增<font>CoxA</font> 组和<font>B</font> 组病毒，并同脊髓灰质炎病毒有较高的交叉反应<font>.</font>
<font>Cox病毒PCR扩增所用引物及探针</font>
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引物及
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序列
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位置
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片段
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意义
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探针
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<font>(5'-3')</font> | <font>(</font> 核苷酸<font>)</font> |
<font>(bp)</font>
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<font>P1(</font> ＋<font>)</font>
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<font>CGGTACCTTTGTGCGCCTGT</font> | <font>64-83</font> |
<font>414</font>
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用于扩增<font>CoxA16</font> <font>，</font> <font>21</font> |
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<font>P2(</font> －<font>)</font>
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<font>TTAGGATTAGCCGCATTCAG</font> | <font>459-478</font> |
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<font>CoxB1-6</font> 及 |
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探针
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<font>TATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGG</font> | <font>430-455</font> |
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<font>P3(</font> ＋<font>)</font>
|
<font>CAACTTAGGAGAAAGCTAGA</font> | <font>2745-2764</font> |
<font>147</font>
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<font>CoxB3</font> 特异性引物 |
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<font>P4(</font> －<font>)</font>
|
<font>CACCTGGTGGTACATACATA</font> | <font>2873-2892</font> |
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探针
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<font>CGGTTCGACCTGGAGCTGAC</font> | <font>2781-2800</font> |
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<font>P5(</font> ＋<font>)</font>
|
<font>GCAACTCCCATCACCTGTAC</font> | <font>6718-6737</font> |
<font>186</font>
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<font>CoxB2-4</font> ，<font>PV1</font> |
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<font>P6(</font> －<font>)</font>
|
<font>ATCACATCATCAACCATATGC</font> | <font>6885-6904</font> |
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探针
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<font>TACTTTGTGAGGGGTGGCAT</font> | <font>6750-6769</font> |
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<font>P7(</font> ＋<font>)</font>
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<font>TATGGTGATGATGTGATCGC</font> | <font>6889-6908</font> |
<font>300</font>
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同上 |
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<font>P8(</font> －<font>)</font>
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<font>TCCCCGTTATGCCAAGCTAA</font> | <font>7170-7189</font> |
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探针
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<font>TTGGATCCTTGGTCCATCTA</font> | <font>7115-7134</font> |
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<font>P9(</font> ＋<font>)</font>
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<font>TGCGGCTAATCCTAACTGCG</font> | <font>461-480</font> |
<font>179</font>
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同上 |
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<font>P10(</font> －<font>)</font>
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<font>CCGGATGGCCAATCCAATA</font> | <font>621-640</font> |
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探针
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<font>CGGTTCCGCTGCAGAGTTGC</font> | <font>522-541</font> |
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二、标本的采集和处理
按常规方法收集鼻咽分泌物、粪便、心肌活检材料及脑脊髓液等标本后，应在0-4℃条件下立即送实验室，分装保存于-20℃或提取模板.由于体液和组织中RNase含量较高，影响制备病毒RNA，故在制备RNA前应按100Ul标本中加40U的RNase酶抑制RNasin.
三、模板RNA制备
1.酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿法:适用于从心肌等活检标本或细胞培养标本.①先将标本(1.5mm3)或1×107 细胞研磨匀浆，加入1ml裂解液(4mol/L异硫氰酸胍-25mmol/L柠檬酸钠PH7.0，50mmol/L2-硫基乙醇，0.5%Sarkosyl)，混合后冰浴中作用15min.②分别加入1/10体积的2mol/L NaAc(PH4.0)，等体积饱和酚，2/10体积的氯仿，混合作用15S.③15000r/min离心15min，收集水相，加入等体积的异丙醇，1-20℃2h，再次离心，用75%乙醇洗一次，收集RNA沉淀.
2.酚-氯仿抽提法:适用于从体液标本中制备RNA.①取体液标本100 Ul于反应管中加入2%，使终浓度为0.5%，再与等体积的酚:氯仿(1∶1)混交，15000g离心15min，收集上层水相.②再向原反应管的有机中加入含0.5%SDS的TNE溶液(10mmol/L Tris-HCL PH7.5，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA)，提取一次，同上离心，收集水相.③将两次收集的水相合并，加入NH4 AC溶液，使以浓度为2mol/L，加2.5倍体积的冷无水乙醇，-20℃置2h以上，15000g离心(4℃)30min，弃上清，收集沉淀，用20UlTE(PH7.5)稀释(含40U的RNasin).
四、逆转录
取5Ul RNA提取模板加入20Ul反应混合液(含50mmol/L Tris-HCl PH8.4，6mmol/LMgcl2 ，10mmol/L DTT，50mmol/L NaCl，250mmol/L的dATP，dCTP、dGTP、dTTP，1umol/L下游引物P2)及40U AMV逆转录酶;再加25-50Ul矿物油封顶后于42℃反应1h，使RNA逆转录为cDNA.
五、PCR扩增
①取上述逆转录后的反应混合物20Ul，加PCR反应液至100Ul反应体积.PCR反应液含有终浓度为50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl PH8.4，1mmol/L MgCl2 ，100Ug明胶，引物1和引物各1U mol/L及四种dNTP各200U mol/L.
②混匀后，94℃水溶5min，冷至55℃.
③加入2.5U Taq聚合酶，振荡摇匀，用100 ul矿物油封顶.
④94℃变性2min，55℃退火2min，72℃延伸2min，重复35个循环.最后于72℃延伸10min.
⑤为提高某些标本检测的敏感性，可取第一次扩增产物1Ul，作模板，加入PCR试剂进行第二次扩增(20-25个循环).
六、扩增产物的检测
(一)电泳法:取10Ul的PCR产物于1%或2%琼脂糖凝胶上电泳，以EB染色显示PCR产物，如出现与目的片段大小相同的扩增产物，则判为阳性.
(二)杂交法:
1.将PCR产物与等体积的0.6mol/L NaOH混合，室温作用15min后，转移到尼龙膜上.
2.用100Ul 2mol/L，NH4 AC溶液中和后，将滤膜置真空炉中烘烤2h.
3.将膜置于5XSSC-1%SDS-0.5%BSA的缓冲液作预杂交.
4.再于含50U l0.4Umol/L碱性磷酸酶标记探针的预杂交液中，45℃，15min.
5.用1%SDS-1×SSC液及1%TritonX-100液100ml，先后各洗2次，再用1×SSC洗1次.
6.将滤膜浸入7.5ml碱性磷酸酶混合物中室温显色3-4h，然后双蒸水洗涤，终止反应.
七、应用和发展
目前，应用上述引物，可进行Cox病毒感染的诊断，特别是用CoxB3病毒的特异引物，扩增病人心肌活检标本中该病毒的核酸，具有很高的敏感性和特异性，同其他Cox病毒及小RNA病毒无交叉反应，并证明CoxB3是心肌炎的重要病原，同原发性扩张型心肌病密切相关，故随着此技术的深入应用，将有助于揭示上述心脏病的真正病因.当然，目前PCR引物的设计还需进一步解决Cox病毒A组、B组特异性引物及型特异性引物问题，这样才能进一步用于临床诊断及分子流行病学的研究，同时也有助于了解Cox病毒变异的规律，为研制预防用的疫苗奠定基础.
