PCR技术应用九:检测人COX病毒
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柯萨奇病毒(Coxsackie viruses简称Cox.病毒)是1948年Dalldorf等采用新生小鼠研究脊髓灰质炎病毒时,在纽约附近的Coxsackie分离发现的一种肠道病毒,属小RNA病毒科,可分为A、B二组.A组有23型(A1-22,24),B组有6型(B1-6),与A组的A9型有共同的组特异性抗原.Cox病毒可引起许多不同的临床症侯,甚至同一病毒可以引起不同的疾病(表1),近年通过PCR技术证明,除可导致脑炎、脑膜炎外,是心肌炎、心包炎的重要病原,其持续感染可能与特发性扩张型心肌病密切相关.本文简述PCR技术在Cox病毒检测中的应用.
一、Cox病毒基因与PCR引物设计
Cox病毒为肠道病毒属,其基因结构具有小RNA病毒科的共同特征(如图所示),可分为衣壳蛋白基因区,无性繁殖功能区和非编码区,其5'-末端即位于衣壳蛋白基因外的碱基序列同其他小RNA病毒具有较高的交叉性.
病毒感染引起的主要临床症侯
主要临床症侯
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组
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主要型别
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无菌性脑膜炎
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A
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2 ,4-7 ,9 ,10 ,12 ,16 |
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B
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所有型别 |
疱疹性咽峡炎
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A
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1-6 ,8-10 ,16 ,21 ,22 |
急性上感
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A
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2 ,10 ,21 ,24 |
|
B
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2-5 |
手口足病
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A
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16 |
流行性胸痛
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A
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4 ,6 ,8-10 |
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B
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1-5 |
心肌炎
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B
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2-5 |
心包炎
|
B
|
1-5 |
麻痹疾病
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A
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4 ,7 ,9 |
|
B
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3-5 |
目前,根据Cox 病毒基因的序列研究结果,人们选择高度保守的编码区和 5' 非编码区( 如nts461-640) ,已设计了多对引物,用于Cox 病毒A 组和B 组的扩增及特异性扩增CoxB3 病毒. 但由于Cox 病毒与其小RNA 病毒基因之间有高度的同源性(70-90% ,位于VP1 基因) ,目前设计的引物除CoxB3 病毒特异性引物外,其余的引物均可用于扩增CoxA 组和B 组病毒,并同脊髓灰质炎病毒有较高的交叉反应.
Cox病毒PCR扩增所用引物及探针
引物及
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序列
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位置
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片段
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意义
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探针
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(5'-3') | ( 核苷酸) |
(bp)
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P1( +)
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CGGTACCTTTGTGCGCCTGT | 64-83 |
414
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用于扩增CoxA16 , 21 |
P2( -)
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TTAGGATTAGCCGCATTCAG | 459-478 |
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CoxB1-6 及 |
探针
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TATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGG | 430-455 |
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P3( +)
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CAACTTAGGAGAAAGCTAGA | 2745-2764 |
147
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CoxB3 特异性引物 |
P4( -)
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CACCTGGTGGTACATACATA | 2873-2892 |
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探针
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CGGTTCGACCTGGAGCTGAC | 2781-2800 |
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P5( +)
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GCAACTCCCATCACCTGTAC | 6718-6737 |
186
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CoxB2-4 ,PV1 |
P6( -)
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ATCACATCATCAACCATATGC | 6885-6904 |
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探针
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TACTTTGTGAGGGGTGGCAT | 6750-6769 |
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P7( +)
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TATGGTGATGATGTGATCGC | 6889-6908 |
300
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同上 |
P8( -)
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TCCCCGTTATGCCAAGCTAA | 7170-7189 |
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探针
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TTGGATCCTTGGTCCATCTA | 7115-7134 |
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P9( +)
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TGCGGCTAATCCTAACTGCG | 461-480 |
179
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同上 |
P10( -)
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CCGGATGGCCAATCCAATA | 621-640 |
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探针
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CGGTTCCGCTGCAGAGTTGC | 522-541 |
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二、标本的采集和处理
按常规方法收集鼻咽分泌物、粪便、心肌活检材料及脑脊髓液等标本后,应在0-4℃条件下立即送实验室,分装保存于-20℃或提取模板.由于体液和组织中RNase含量较高,影响制备病毒RNA,故在制备RNA前应按100Ul标本中加40U的RNase酶抑制RNasin.
三、模板RNA制备
1.酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿法:适用于从心肌等活检标本或细胞培养标本.①先将标本(1.5mm3)或1×107 细胞研磨匀浆,加入1ml裂解液(4mol/L异硫氰酸胍-25mmol/L柠檬酸钠PH7.0,50mmol/L2-硫基乙醇,0.5%Sarkosyl),混合后冰浴中作用15min.②分别加入1/10体积的2mol/L NaAc(PH4.0),等体积饱和酚,2/10体积的氯仿,混合作用15S.③15000r/min离心15min,收集水相,加入等体积的异丙醇,1-20℃2h,再次离心,用75%乙醇洗一次,收集RNA沉淀.
2.酚-氯仿抽提法:适用于从体液标本中制备RNA.①取体液标本100 Ul于反应管中加入2%,使终浓度为0.5%,再与等体积的酚:氯仿(1∶1)混交,15000g离心15min,收集上层水相.②再向原反应管的有机中加入含0.5%SDS的TNE溶液(10mmol/L Tris-HCL PH7.5,100mmol/L NaCl,1mmol/L EDTA),提取一次,同上离心,收集水相.③将两次收集的水相合并,加入NH4 AC溶液,使以浓度为2mol/L,加2.5倍体积的冷无水乙醇,-20℃置2h以上,15000g离心(4℃)30min,弃上清,收集沉淀,用20UlTE(PH7.5)稀释(含40U的RNasin).
四、逆转录
取5Ul RNA提取模板加入20Ul反应混合液(含50mmol/L Tris-HCl PH8.4,6mmol/LMgcl2 ,10mmol/L DTT,50mmol/L NaCl,250mmol/L的dATP,dCTP、dGTP、dTTP,1umol/L下游引物P2)及40U AMV逆转录酶;再加25-50Ul矿物油封顶后于42℃反应1h,使RNA逆转录为cDNA.
五、PCR扩增
①取上述逆转录后的反应混合物20Ul,加PCR反应液至100Ul反应体积.PCR反应液含有终浓度为50mmol/L KCl,10mmol/L Tris-HCl PH8.4,1mmol/L MgCl2 ,100Ug明胶,引物1和引物各1U mol/L及四种dNTP各200U mol/L.
②混匀后,94℃水溶5min,冷至55℃.
③加入2.5U Taq聚合酶,振荡摇匀,用100 ul矿物油封顶.
④94℃变性2min,55℃退火2min,72℃延伸2min,重复35个循环.最后于72℃延伸10min.
⑤为提高某些标本检测的敏感性,可取第一次扩增产物1Ul,作模板,加入PCR试剂进行第二次扩增(20-25个循环).
六、扩增产物的检测
(一)电泳法:取10Ul的PCR产物于1%或2%琼脂糖凝胶上电泳,以EB染色显示PCR产物,如出现与目的片段大小相同的扩增产物,则判为阳性.
(二)杂交法:
1.将PCR产物与等体积的0.6mol/L NaOH混合,室温作用15min后,转移到尼龙膜上.
2.用100Ul 2mol/L,NH4 AC溶液中和后,将滤膜置真空炉中烘烤2h.
3.将膜置于5XSSC-1%SDS-0.5%BSA的缓冲液作预杂交.
4.再于含50U l0.4Umol/L碱性磷酸酶标记探针的预杂交液中,45℃,15min.
5.用1%SDS-1×SSC液及1%TritonX-100液100ml,先后各洗2次,再用1×SSC洗1次.
6.将滤膜浸入7.5ml碱性磷酸酶混合物中室温显色3-4h,然后双蒸水洗涤,终止反应.
七、应用和发展
目前,应用上述引物,可进行Cox病毒感染的诊断,特别是用CoxB3病毒的特异引物,扩增病人心肌活检标本中该病毒的核酸,具有很高的敏感性和特异性,同其他Cox病毒及小RNA病毒无交叉反应,并证明CoxB3是心肌炎的重要病原,同原发性扩张型心肌病密切相关,故随着此技术的深入应用,将有助于揭示上述心脏病的真正病因.当然,目前PCR引物的设计还需进一步解决Cox病毒A组、B组特异性引物及型特异性引物问题,这样才能进一步用于临床诊断及分子流行病学的研究,同时也有助于了解Cox病毒变异的规律,为研制预防用的疫苗奠定基础.