PCR技术应用十一：病毒学诊断

 

 

 

　　甲型肝炎病毒是甲型肝炎的病原体.甲型肝炎呈世界性分布，其传染源是甲型肝炎病人及病毒携带者.HAV主要随粪便排出，但在血液、唾液、胆汁和十二指肠液也可查出.本病的传播主要是通过粪--口途径，如经日常生活接触传播，经污染饮水或食物而传播.其中无黄疸型肝炎患者容易漏诊或误诊，是重要的传染源，具有重要的流行病学意义.除病人外，还有亚临床感染，其无症状或有较轻微病状，转氨酶轻度升高，血清中可查出抗HAVIgM，粪便中可检出HAAg或HAV颗粒，亦是不可忽视的较重要的传染源.

　　甲型肝炎病毒经粪--口途径进入消化道后，首先在肠上皮和局部淋巴结细胞内繁殖，然后进入血液形成病毒血症，经血液循环到达其靶器官--肝细胞中定居繁殖，引起肝功能异常，出现发热、巩膜黄染、小便浓茶色、恶心、厌油腻、血清转氨酶升高等症状或体征.

　　甲型肝炎病毒为单股正链RNA病毒.直径约27nm、呈20面立体对称的球形颗粒，1982年国际病毒分类委员会曾将其分类为微小RNA病毒科肠病毒72型，随着对HAV的不断深入研究，发现其与肠病毒属的成员有很多不同之处，国际病毒分类委员会于1991年将HAV重新分类为小RNA病科肝病毒属，也有人建义命名为肝RNA病毒属.它即强调了HAV的嗜肝性，又突出了HAV的基因是RNA，同时又与HBV嗜肝DNA病毒属相对应.

一、甲型肝炎病毒的分子生物学

(一)HAV基因组

　　HAV全基因约含7500个核苷酸，各HAV株间序列中的核苷酸数略有不同.其中HAV野毒株HM-175基因组全长7478个核苷酸，分5'端非编码区和3'非编码区及居于中间的开放阅读框架区(编码区)三部分.5'端非编码区是HAV基因组中最保守的部分.其株间核苷酸序列一致性达96～99%.此区共有734个核苷酸.5'非编码区有2个聚嘧啶环，邻近5'端的第一个聚嘧啶环是独特的，不为其它RNA病毒所共有;第二个聚嘧啶环位于编码区的起点附近，与其它小RNA病毒同源.5'非编码区含有识别和连接宿主核蛋白体的重要遗传信息.开放阅读框架区编码2227个氨基酸的多聚蛋白.被一个天门冬酰胺密码子分开的2个蛋氨酸密码中的任何一个可能是翻译的起点.其编码多聚蛋白的基因从5'端开始可分为三个区，即P1区、P2区和P3区.P1区编码4个衣壳蛋白1A～1D，通常称为VP1、VP2、VP3和VP4.VP1最大可能和VP3一起构成抗原的免疫决定簇.P2区是转录及基因调控区.P3区编码非结构蛋白3A、3B、3C和3D，HAV蛋白3B可共价结合于HAVRNA5'端，与启动RNA的生物合成或与病毒的装配有关;HAV3D蛋白为依赖RNA的RNA多聚酶.代表了多聚酶的活性部位.

　　P1区:位于HAVRNA735～3107位核苷酸区域，为HAV衣壳蛋白编码区，可编码791个氨基酸.从5'端开始按其次序分别称为VP4(735～803)，VP2(804～1469)，VP3(1470～2207)，VP1(2208～3107).

(二)HAVRNA的基因型

　　HAV只有一个血清型.但通过对HAV核酸序列分析，发现HAV有若干个基因型.1991年Robertson用HAVP1区VP1基因的不同片段作为分型标准，将22株来自世界不同地区的HAV分为三个基因型(Ⅰ～Ⅲ型)，1992年他又对全球29个国家的152株HAV，以VP1和P2区的不同序列作基因分型，根据基因分型标准，把核苷酸序列差异<15%的划为同一基因型.从而将HAV分为7个基因型(Ⅰ～Ⅶ型)，人类HAV有四个型，(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅶ)，非人灵长类亦有四个型(Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ).其中的Ⅲ型为人类和非人灵长类所共有的混合型.人类HAV各基因型间，核苷酸异源性为15～20%.同一基因型的不同亚型之间，异源性低于7.5%，同一亚型的地方流行株核苷酸异源性低于3%.但变异的核苷酸大多发生在密码子的第三位上，不会改变氨基酸的组成，故各株间的抗原性差异不大.

(三)基因变异

　　HAV的变异主要有自然变异，生物学变异和细胞培养变异及减毒变异.自然变异主要发生在P1区，其中VP1和VP3区变异较多见.HAV氨基酸的变异常发生在VP3的65、70和VP1的102、105、174、178和221位，而VP3的70位几乎在所有的HAV株中都存在变异.

　　Funkhouser等将在AGMK细胞上培养生长的HAV-175株，转种到MRC-5细胞上培养，然后进行核苷酸序列比较分析，发现该转种株(适应株)有13个核苷酸发生变异.其中有4个在5'非编码区，9个在编码区，Cohen等对HAV野毒株HM-175和减株HM-175/7MK5的cDNA核苷酸序列进行比较，发现有24个核苷酸发生变异，并导致12个氨基酸发生了变异.其中5'非编码区有7个核苷酸发生变异，P1、P2和P3区分别有3、8和5个核苷酸发生变异;3'端非编码区有一个核苷酸变异，因而认为HAV的减毒是由于其基因组中相对小量的核苷酸改变所致.生物学变异主要是在核苷酸变异的基础上，发生了对细胞的亲和性的改变及HAV毒力性的改变.

(四)引物的设计

序号	引物序列	位置		扩增片段(bp)
1.	FA，5'-GGAAATGTCTCAGGTACTTTCTTTG	2390～2414	互补链	248bp
	FB，5'-GTTTTGCTCCTCTTTATCATGCTATG	2167～2192
2.	FA，5'-GGCCCACTGGAGTAAACCAGGCCA	2674～2697)	互补链	531bp
	FB，5'-GTTTTGCTCCTCTTTATCATGCTATG	2167～2192
3.	F1，5'-CAACTGCAGCCAGTGCTCCAGACACGGC	2838～2865)	互补链	715bp
	F2，5'-AGGAATTCACTTGAATGTTTTGCTCCTCTT	2150～2179)
4.	P∶5'-TCCCAGAGCTCCATTGAA-3'	2976～2993)	互补链	300bp
	N∶5'-CATTATTTCATGCTCCTCAG-3'	3257～2376

二、病原学检测现状

　　1.HAV及HAAg的检测:在潜伏期未与发病早期可用免疫电镜检出HAV，亦可用RIA和ELISA检测血、尿、粪中的HAAg，此期也可采取上述标本对HAV进行培养鉴定.

　　2.检测抗HAV、抗-HAVIgM和抗HAVIgA:急性期可用ELISA或RIA检测血清中抗-HAVIgM，它是确诊甲型肝炎的特异性血清学指标.其次抗-HAVIgA对于甲肝的早期诊断亦有意义.

　　3.HAVRNA:甲肝潜伏期与急性期早期，在血、尿、粪中用PCR技术或分子杂交检测到HAVRNA，即可确诊.

三、PCR应用评价

　　由于在急性期与潜伏期未在血、尿、粪中均有HCV存在，用PCR技术扩增检测HCVRNA，非常适用于甲肝的早期诊断.它不仅可用于现症病人的早期诊断，还能用于亚临床感染者、隐性感者的检测及环境污染HAV的监测.是进行流行病研究的重要手段.

　　但HCV是RNA病毒，做PCR时先要将RNA反转录成cDNA后才能做PCR，而且一般要做巢式或双PCR才能得出好的结果.其技术要求精度较高，程序较为繁复，但其特异性与敏感度是其它技术不可比拟的.

四、进一步深入研究的课题方向

(一)用PCR进行分型研究

　　建立HAVPCR分型方法，使HAV的流行病学研究进入分子水平，用其来分析HAV的流行因素，流行特征及地理分布，确定暴发与传染源之间的联系，对甲型炎肝的防治具有重要意义.

(二)毒力的分子生物学研究

　　研究HAV毒力的分子学基础，有助于分析研究野毒株与减毒株之间核苷酸的变异性情况，确认疫苗毒力减弱的基因标志，可用于制备基因工程疫苗、监视疫苗可能出现的回复突变.

乙型肝炎病毒

　　乙型肝炎是一种世界性传染病，我国是高流行区，我国有50%～70%的人群受过乙型肝炎病毒的感染，有8%～10%为乙型肝炎表面抗原携带者，约有一亿人口，根据1980年全国调查表明，我国现在患肝炎的病人约2000万人，其中60%以上为慢性肝炎患者.乙型肝炎病毒又与肝硬变以及原发性肝细胞肝癌密切相关，我国同时也是肝癌的高发国家;如何预防、如何治疗、急待解决.解决这一问题的关键之一在于准确无误的诊断，要达到准确无误的诊断，就需要深入细致的研究乙型肝炎病毒的分子生物学特点，尽可能地采用现代分子生物技术加以研究和检测.

(一)病原学:HBV为嗜肝DNA病毒(hepadna Virus).

　　1.形态:完整的HBV颗粒呈园形，直径42nm，双层结构，由外壳蛋白和核心成分组成.外壳蛋白包括S、前S1和前S2蛋白，核心成分则包括核心蛋白(HBCAg)、病毒(HBVDNA)和DNA多聚酶(DNA).

　　2.基因组:HBV基因组由一环形、部分双链DNA组成.HBVDNA长链(一)约3.2Kb、短链S(+)约为400～1900bp.该基因组包括4个可被转录的开放读码区域---S、C、P和X区，P区与另外三个区重叠.S区由前S1、前S2和S基因组成，主要码组成病毒外壳的三种不同蛋白，即大蛋白、中蛋白和主蛋白，C区编码白(HBAg).P基因编码病毒DNA多聚酶，为复制所必需.X基因产物为X蛋白，与HBV反式激活等功能有关.

(二)流行病学

　　1.地区分布:呈世界性分布，但不同地区差异很大，按人群中HBsAg携带率高低可划分为三类:①低流行区(携带率<1%)，如北美、北欧、英等;②中流行区(1-5%)，如南欧、西南亚、俄罗斯等;③高流行区(10-20%).如东南亚、非洲和我国等.另外HBs5Ag的亚型地理分布也有明显差异.adr多见于东南亚和我国;adw多见于美洲，澳大利亚和北欧;ayr罕见;而ayw分布最广，由西非、北非、南欧、经地中海至中东、南亚次大陆.

　　2.传染源:各种类型的乙肝患者和HBsAg携带者.潜伏期为6周至6个月，平均为3个月.

　　3.传播途径:由于HBV存在于血液，唾液、泪液、腹水、羊水、尿、精液、阴道分泌物、月经血和乳汁等中，所以传播途径多样且复杂.但主要经血液、母婴和接触传播.

(三)引物的设计

	序列	位置	片段大小(bp)
HPV6/11	引物15'ATGCCTCCACGTCTGCAAC3'	115 ～133	112
	引物23'TACGTGACTGGTGGCCGTCTC5'	208 ～227
HPV16/33	引物15'TGAGGTATATGACTTTGCTTTT3'	223 ～244	183
	引物23'AATTAATCCACATAAT5'	401 ～416
HPV18	引物15'TGTCATAACCTTGAATGTCT3'	428 ～437	99
	引物23'AAATGTATAGATTTTTATTC5'	508 ～507

HPV 型特异型引物

型别	序列	片段大小(bp)
HPV6	引物15'AGACCAGTTGTGCAAGACGTTTAA3'	263
	引物23'GATTTGTTCTGTAGAATCTGCACG5'
HPV11	引物15'AGACCAGTTGTGCAAGACGTTTAA3'	144
	引物23'ACACACCGCTCTGTTGAAAGGGAA5'
HPV16	引物15'ACCGAAACCGGTTAGTATAAAAGC3'	576
	引物23'TAAACGTTGGTCTCTGTTGACTAG5'
HPV18	引物15'CACACCACAATACTATGGCGCGCT3'	360
	引物23'CGGTCTTTGGCAACTTAGGTCGTC5'
HPV33	引物15'GCAGTAAGGTACTGCACGACTATG3'	413
	引物23'TGCTAAAGTATTATAAAGCCCAGC5'

　　目前研究所采用的引物主要为上述几种，从而构成了HPV 通用型诊断试剂和分型诊断试剂，其中，分型诊断试剂组成了5 重性，即将HPV6 ～33 各型引物混合在一起，一次PCR 实验，即可对5 种型别的HPV 感染进行确诊.

　　应用前景：PCR 技术在诊断HPV 感染和致癌研究中有其广阔的应用前景. 现已应用于检测宫颈阴道组织细胞、阴肛部肿瘤、多种疣组织和口腔粘膜细胞中的HPV. 由于该方法使简便快速，可应用于大范围内的流行病调查.

　　PCR 检测HPV 的核心问题：是如何使PCR 发挥其实际应用价值. 以往，PCR 应用于实际检测中的限制在于方法的繁琐与较高的假阳性，如何克服这两个问题是促成PCR 临床实际应用的关键. 从理论上讲，PCR 方法可以变得更为简洁和定固化，亦即程序化，其结果应是100% 的特异和可靠. 所以，实际工作是可以解决好上述两个关键问题的. 首先，应用于PCR 的关键试剂为TaqDNA 聚合酶和特异引物对，作为TaqDNA 聚合酶，它对模板的种类要求不严，它有很强的适应性，活性范围亦很好(70 ～79 ℃) 因而它可对较为“粗糙”的标本进行较好的扩增，故样品的准备过程的程度对扩增反应本身来讲，影响不大，实践中我们对该过程进行了大量的简化及改造，从而获得成功，这极有利于PCR 的常规化，易于为实验者所接受. 另外重要的一点还有，简化及快速的PCR 程序，对于防止假阳性更有利. 因为PCR 的假阳性经常是因为样品间的交叉污染及空气中的扩增污染造成的，简短，快速的实验程序能有效的的防止上述污染，这已为实践所证明.PCR 引物的特异性取决于引物的设计，选择合适的扩增片段是设计引物的关键环节.

　　总之，PCR 检测HPV 不管从特异性方面还是从灵敏性方面讲具有其经方法难以匹敌的优势，结果的可靠性及可信性应该是最好的，是最权威性的检测方法，加之本身方法的极大进步，对于扩充其应用领域极其重要。