免疫检测知识

5.3.2常规条件下已知值质控血清变异（routine conditions variance-known value,简称RCVK）的测定。
　　做常规检验的技术人员，在常规检验的条件下，将质控血清放在常规检测样本中，进行20次检验，结果计算同OCV法。一般认为RCV的SD在OCV的SD两倍范围内可以接受。若太大应该查找原因，使其向OCV的SD值靠近。在改进实验室条件后（例如较正加样器，纠正洗板操作，调正温育温度等），重新进行RCVK的测定。如果RCVK的SD值更小，说明OCV不是最佳条件下测定的，应重新再测OCV。常规条件下，RCVK肯定要比OCV大。通过质控控制各项条件，使RCVK的数据尽可能接近OCV值。RCVK的数据反映该实验室日常工作的质量，用于作质控图，对室内检验的结果进行控制，每日检验的结果，报告能否发出。
5.3.3常规条件下,未知值质控血清变异(routine conditions variancl-unknown value 简称RCVU)的测定
　　有时为了避免主观性,再作RCVU测定。测定步骤同RCVK，但检测的操作者不知质控血清的定值，或在操作者不知哪份是质控血汪清的条件下进行常规检验，以排除操作者的主观性。在此不再举例说明。
5.3.4质控图
　　通过以上三步骤，可以开始作室内质控图，根据RCVK的和SD作质控框图。利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，当没有更换另一批号试剂盒和另一批号质控血清时，该质控图可以连续作下去。 质控血清的S/CO值低于-2SD的范围,属"告警"，应寻找原因并在质控图上记录查出的原因。
　　ELISA试验中，各种检验项目的误差允许范围均有待在实践中得出结论，以上只是举例说明质控方法，不是定论。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时，一次超过2SD应作为"告警"，二次超出2SD为"失控"。当质控过程中，出现失控时，出现失控时，应查找原因，通常是试剂盒或质控血清失效造成。更换试剂盒或更换质控血清，找出原因纠正后重新检验。如果检验结果仍达不到要求或找不到原 因时，应重复进行OCV的检验。如果OCV检验的结果仍是好的，说明常规操作出现问题。
一般认为：①一次超出3SD；②连续二次超出2SD；③3-5次连续处于一侧的2SD之内；
　　　　　④5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控。
第③、④种情况，单独依靠记录往往是不易察觉的，但在质控图上可以清晰地发现这种失控。
5.3.5统计学计算方法--"即刻性"质控
　　以上介绍的质控方法基本上与临床化学测定的质控方法相同，但ELISA有其特殊性，最合适的质控方法尚待研究建立。有些实验室不是每天进行ELISA项目的检验，而ELSIA试剂盒效期短，用一批号试剂盒连续常规测20次，难度较大。采用"即刻法"质控统计方法，只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。"即刻法"的建立具体计算方法如下：
1)先将测定值从小到大排列
2)计算X和SD。
3)计算SDI上限和SDI下限值。
4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值＜n2SD时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI上限和SDI下限有 一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD~3SD范围，处于"告警"状态；当SDI上限和SDI下限有一值＞n2SD时，说明该值已在3SD范围之外，属"失控"。数值处
　于"告警"和"失控"状态应舍去，重新测定该项质控血清和病人样本。舍去的只是失控的这次数值，其他次测定值仍可继续使用。
　　即刻性质控统计方法，适于ELISA测定的质控。
　　当检测的数值超过20次以后，不必再使用"即刻法"质控统计计算，可以转入常规的质控图的质控。将前20次的数值求出的和SD作质控框架图，第21次的数值，依次点入即可。
5.4室间质量评价（external quality assessment,简称EQA）
　　室间质量评价简称室间质评，是由质控中心采用一系列的办法连续地、客观地评价各实验室的试验结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。各实验室试验结果报到质控中心，经过统计分析，得出相互比较的结果。这种评价不能控制各实验室每天发出的检验报告，而是一种回顾性评价。室内质控主要监测试验结果的精密度，而室间质评主要控制试验结果的准确度，不能互相替代。参与质评的实验室应先做好室内质控。 5.4.1室间质评的方法
1、 发质控物进行调查
　　这是国内外室间质评的常用形式。部临检中心对乙肝标志物ELISA检验的室间质评采用定期发放质控物至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果报至部临检中心。部临检中心经统计分析，将评价结果寄回各实验室。通过评价，各实验室了解本室工作质量，发现差距，并设法改进，以不断提高检验质量。
　　这种评价方式有一定缺点，即各实验室常对质控物特殊对待，在检验时选用特殊试剂盒，选派特别的技术员进行检验，有的实验室互相和对结果并作修改。这就使EQA的结果不能反映该实验室日常工作水平。
2、 派观察员到实验室进行试剂调查
　　这种调查事先不通知，临时派观察员到实验室，指定采用常规方法，检验规定的一组标本，进行评价。
　　这种调查方式，容易发现该实验室存在的实际问题，可以直接给予指导和帮助，解决问题，提高检验质量。这种调查通常可以使用真实样本，避免采用质控物的一些缺点。

6、ELISA试剂的临床质量评价
　　ELISA试剂的评价（evaluation）分两个方面：一是试剂本身的质量评价，符合一定要求后才能生产供应；一是在临床应用中效果的评价。以肝炎ELISA诊断试剂为例，首先必须通过中国药品生物制品检定，以得到生产的许可。检定内容除包装、标签、说明书等外，对试剂的性能，如特异性、灵敏度、精密度和线性等均需逐项检定，通过对一系列参比品的检测，结果符合要求者才为合格。ELISA试剂的临床质量评价是用该试剂对临床样本进行检测，以观察其实际应用价值。部临检中心对乙肝ELISA诊断试剂在这方面进行了工作，通过质量评价，促进了试剂质量的提高。
6.1　诊断试剂临床质量评价要点
　　从临床应用角度考核检验试剂的可靠性，是以其能否区分健康与疾病的能力作为依据的。目前还很难找到100%可靠的试验，任何试验都会出现假阳性或假阴性。判断试验的可靠性常以其灵敏度及特异性作为考核标准。临床应用的灵敏度用疾病患者试验阳性的百分率表示，特异性以无病者试验阴性的百分率表示。进行这种评价，首先需要收集有关的病人血清，然后用公认的检测该项标志物最可靠的试剂进行测定，以确定其为阳性或阴性。
　　这一组表明测定物为阳性或阴性的血清组成"血清盘"（panel）。被评价的试剂测定此血清所得结果与血清盘标明的结果的关系如下表：
血清盘结果 合计
＋ －
受检试剂结果 ＋ a b a+b
－ c d c+d
合计 a+c b+d A+b+c+d
表中a为真阳性，b为假阳性，c为假阴性，d为真阴性。
被评价试剂的各项性能指标按以下分式计算：
灵敏度(%)=a/(a+c)×100%
特异性(%)=b/(b+d)×100%
符合率(%)=(a+d)/(a+b+c+d) ×100%
一般认为灵敏度或特异性>90%为良好。符合率是综合灵敏度和特异性的指标。
6.2　临床考核血清盘的制备要求
1、 采用人的原血清；
2、 血清盘应具有相应的稳定性；
3、 血清盘中样本不含防腐剂，或只含极微量的、不影响检验结果的防腐剂；
4、 血清盘所包含的阴性样本和阳性样本约各占一半；
5、 阳性样本中，应有一定数量的强阳性和弱阳性样本；
6、 血清盘中应有一定数量的临界值上、下含量的样品，以检验试剂的灵敏度。
7、 血清盘中应包含与该项检验相关的病种样本和已积知具有干扰物质（RF因子）的样本，以检验试剂的特异性。
6.3　临床考核血清盘的建议
　　以抗-HBc-IgM为例，部临检中心收集近百例临床肝炎病人的样本，经美国abbott公司抗-HBc-IgM试剂反复检验筛选。选出血清70份，其中阳性29份，阴性41份，组成抗-HBc-IgM临床考核血清盘。在70份样本中，除7份为无病历的质控血清外，抗-HBc-IgM阳性的22份样本中含临床诊断急性肝炎16例、慢性活动性肝炎5例、重症肝炎1例；抗-HBc-IgM阴性的40份样本中，含临床诊断慢性迁延性肝炎24例、急性肝炎例（均为恢复期采的血样）、慢性活动性肝炎8例（其中5例为恢复血样）。
　　因此，这套抗血清盘用于商品试剂的临床考核，可以将临床上乙肝急性期、慢性活动期病人区分开，具有临床诊断意义。