利用聚合酶链反应制备放射性标记的DNA探针

  利用聚合酶链反应制备放射性标记的 DNA 探针

 

1.      在一个 0.5 ml 的薄壁微量离心管中设置下列扩增 / 放射性标记反应体系：

10 ×扩增缓冲液                5.0 μ l

10 mmol/L dNTP 溶液           1.0 μ l

0.1 mmol/L dCTP              1.0 μ l

20 μ mol/L 正向寡核苷酸引物    2.5 μ l

20 μ M 反向寡核苷酸引物         2.5 μ l

模板 DNA （ 2 ～ 10 ng 或约 1 fmol ）    5 ～ 10 μ l

10 mCi/ml[ α -³² P] dCTP ( 比活性 3000 Ci/mmol)        5.0 μ l

水                             加至 48 μ l

在反应体系中加入 2.5 单位耐热 DNA 聚合酶。轻敲管壁以混合各组分。

2.      如果热循环仪无加热盖，可加一滴（ 50 μ l ）轻矿物油或一粒石蜡于反应混合物之上，以防止样品在反复加热及冷却的循环中蒸发。将微量管放入热循环仪。

3.      通过变性、复性和聚合扩增样品，反应时间见下表。

循环数	变性	复性	聚合
30 个循环	94 ℃ 30 ～ 45s	55 ～ 60 ℃ 30 ～ 45s	72 ℃ 1 ～ 2 min
最后一个循环	94 ℃ 1 min	55 ℃ 30s	72 ℃ 1 min

4.      从热循环仪中取出反应管，用微量移液器尽可能地从反应液上层吸去矿物油。用 50 μ l 氯仿抽提反应液，以除去剩余的矿物油。室温下离心 1 min 以使液相与有机相分离。

5.      吸去上层水相，转移到一个清洁的微量管中，加入载体 tRNA （ 10 ～ 100 μ g ）或糖原（ 5 μ g ），用等体积的 4mol/L 乙酸胺和 2.5 体积的乙醇沉淀 DNA ，放置于 -20 ℃ 1 ～ 2 h 或 -70 ℃ 10 ～ 20 min 。 4 ℃下以最大速度离心 5 ～ 10 min 收集沉淀的 DNA 。

6.      将 DNA 溶于 20 μ l TE(pH 7.6), 用 Sephadex G-75 离心柱层析除去残存未掺入的 dNTP 和寡核苷酸引物。

7.      用液体闪烁计数仪测定 1.0 μ l 离心柱外水体积的放射活性。贮存剩余的放射性标记 DNA 于 -20 ℃以备用。