IL-2 DNA探针的标记

IL-2 DNA 探针的标记

 

    地高辛是一种仅存在于洋地黄类物质花叶中的类固醇半抗原，又称异羟基洋地黄毒甙配基，地高辛精可以通过一个11个碳原子的连接臂与尿嘧啶核甘酸嘧啶环上的第5组碳原子相连接形成地高辛精标记的尿嘧啶甘酸:Boehringer Mannheim公司出售的地高辛精标记核苷酸有dig^- UTP，dig^- dUTP和dig-dduTP，它们分别适用于RNA探针、DNA探针和寡核苷酸探针的标记。地高辛精标记核甘酸主要通过酶反应标记核酸探针，用标记探针做原位杂交，杂交体用特异性抗地高辛精抗体通过免疫组化技术检测。在适宜的标记反应条件下，一般在20-25个核苷酸中带有一个标记的核苷酸。这一标记密度最利于半抗原与碱性磷酸酶标记的抗地高辛精之间的反应。因为一个标记抗体大约覆盖20个核苷酸。Boehringer Mannheim公司生产的地高辛精DNA标记试剂盒和地高辛检测试剂盒在分子杂交中的应用愈来愈广泛。

【试剂与仪器】

（1）         地高辛标记和检测试剂盒（Boerhinger Mannheim，No1093657）：其中包括六聚核苷混合物，dNTP混合物，Klenow聚合酶等

（2）         乙醇，LiCl，TE缓冲液等

（3）台式高速离心机，水浴箱

【操作步骤】

（1）         将DNA(1μg-3μg)加热95℃(或100℃)10min，随即在冰浴中骤冷，DNA充分变性对探针标记十分重要。5ul DNA作为对照；

（2）         将离心管置于冰上，按顺序加入下列试剂：①1μg~3μg新鲜变性DNA；②2μl六聚核苷混合物；③2μl dNTP混合物，加入蒸馏水使总体积达到19μl，再加入1 μl Klenow聚合酶；

（3）         离心片刻后，将离心管置37℃恒温箱内孵育60min。延长孵育时间可长达20h，可使标记量增加；

（4）         加入2μl 0.2mol/L EDTA(pH8.0)，终止酶反应；

（5）         加入2.5μl 4mol/L LiCl 和75μl乙醇（-20℃预冷），混匀置-70℃30min或-20℃ 2h使标记探针沉淀；

（6）         离心（16500r/min），弃上清液，用50μl 70%冷乙醇轻洗沉淀物；

（7）         将沉淀物置于真空干燥仪内干燥后，溶解于5μ0l TE缓冲液-20℃冰箱保存。

【注意事项】

（1）         随机引物标记前必须将探针变性：100℃沸水浴10分钟后，迅速插入冰中，缺口平移则不需变性。

（2）         DNA片段必须小于10kb。大于10kb的DNA序列则需要酶切。最小能为随机法标记的片段是52bp，一般探针长度以大于100bp为好。

（3）         随机法标记过夜能够获得较高的标记产量。

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