细胞凋亡检测：生化特征的检测方法

根据调亡的生化特征的检测方法

 

一、琼脂糖凝胶电泳

 

1 ）常规的琼脂糖凝胶电泳

 

方法一：

1． 收集细胞（ 5 × 10⁶ ） 1000r/min ，离心 5min ，去上清。

2． PBS 洗一次， 1000r/min ，离心 5min ，去上清。

3． 加细胞核裂解液 500 μ l 重悬细胞， 50 ℃水浴， 3 ～ 5h ，不时振摇或 37 ℃过夜。

4． 加 0.5ml 平衡酚抽提，上下颠倒几次混匀， 6000r/min ，离心 5min 。

5． 上清移至另一 Ep 管，加 0.5ml 氯仿：异戊醇抽提，上下颠倒几次混匀， 6000r/min ，离心 5min 。

6． 上清移至另一 Ep 管，加 50 μ l 的 3mol/L 乙酸钠和 2ml 预冷无水乙醇，上下颠倒几次混匀，可见絮状白色沉淀物。

7． 置液氮 5 ～ 10min ， 12 000r/min 离心 10min 沉淀 DNA ，去上清，真空抽干或风扇下吹干残存液体。

8． 加 50 ～ 100 μ l TE 缓冲液，另加 5 μ l RNase ， 37 ℃水浴 30min 。

9． 取 20 μ l 加上样缓冲液 2 ～ 5 μ l ， 1 ％琼脂糖凝胶电泳（电压 50V ， 1.5 ～ 2h ）， UV 下观察。

 

 

方法二：

1． 离心收集细胞（ 5 × 10⁶ ）， PBS （无 Ca^{2 ＋} 和 Mg^{2 ＋} ）洗 1 ～ 2 次。

2． 0.5ml TBE 溶液重悬， 37 ℃孵育 30min 。

3． 1mg/ml 蛋白酶 K 37 ℃处理 30min 。

4． 加入上样缓冲液 0.1ml 。

5． 25 μ l 上样， 1.5 ％的琼脂糖凝胶上电泳， 2V/cm 6h 。

 

 

方法三：

1． 收集细胞悬液（ 10⁶ 细胞），低速离心（ 1000r/min ，离心 5min ）。

2． 去上清，沉淀加 0.4ml 低渗缓冲液作用 1h 。

3． 13 000r/min ，离心 10min ，将上清转移至另一 Eppendorf 管中，加等量 50 ％异丙醇和 0.5mol/L NaCl 混匀，置液氮 5min 。

4． 12 000r/min ，离心 10min ，弃上清，沉淀真空抽干。

5． 加 TE 100 μ l ， 65 ℃加热 10min ，取 20 μ l ，加 1 ～ 2 μ l 上样缓冲液，电泳观察。

 

 

方法四：

1． 收集细胞， 1000r/min 离心 5min ，去上清。

2． 用冰预冷的 70 ％乙醇固定，可长期保存于－ 20 ℃冰箱。

3． 1000r/min 离心 5min ，去除固定液，用约 0.5ml 的 PBS 重悬细胞。

4． 转入 Eppendorf 管中，同法离心，去上清。

5． 细胞用 40 μ l PC 缓冲液重悬，室温 30 ～ 60min 。

6． 1000r/min 离心 5min ，吸上清于新的 Eppendorf 管中，真空浓缩 15min 。

7． 加入 0.25 ％ NP-40 溶液 3 μ l ， 1mg/ml RNase A 溶液 3 μ l ， 37 ℃， 30min 。

8． 加入 3 μ l 蛋白酶 K ， 37 ℃， 30min 。

9． 加入 12 μ l 样品稀释液，含溴化乙锭的 1.5 ％琼脂糖电泳，观察。

 

 

2 ）琼脂糖凝胶电泳的定量检测

 

简易末端标记法

 

1． 按常规提取细胞 DNA 。

2． 在 0.5ml 的 EP 管中加入细胞 DNA ，反应体系如下：细胞 DNA 0.5 ～ 1.0 μ g ， 10 ×缓冲液 2 μ l ， ³² P-dATP （或 -dCTP ） 0.5 μ Ci ， Klenow 聚合酶 5U ，双蒸水加至 20 μ l 。

3． 混匀后稍加离心，室温反应 30min 。

4． 加 1 μ l 0.5mol EDTA 终止反应。

5． 常规酚 / 氯仿 / 异戊醇抽提 1 次，无水乙醇沉淀 DNA ，真空抽干。

6． 溶于 20 μ l 的 TE 缓冲液中。

7． 取标记 DNA 在 1.8 ％琼脂糖凝胶上点样， 50V 电泳约 2h 。

8． 电泳后的凝集置滤纸上烘干，进行放射自显影。

 

 

5’ 末端 ³² P 标记法

 

细胞 DNA 的提取

1． 细胞悬液离心后，沉淀加消化缓冲液 0.5ml ， 50 ℃ 3 ～ 5h ，或 37 ℃过夜。

2． 用等体积的酚：氯仿：异戊醇抽提细胞裂解液。

3． 将水相转移至新的试管，加入 150mmol/L 乙酸钠和 10mmol/L 氯化镁。

4． 加入 2 倍体积的预冷无水乙醇，置液氮 5min 或－ 20 ℃ 12h 。

5． 12 000r/min 离心沉淀 DNA ， 70 ％乙醇洗 1 次后，真空抽干。

6． 溶于 20 μ l 的 TE 缓冲液中。

7． 加入终浓度为 10 μ g/ml RNase ， 37 ℃， 30min 。

8． 同法用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。

9． 溶液 20 μ l 的 TE 缓冲液中，－ 20 ℃ 保存备用。 DNA 含量测定：用 260nm 波长紫外分光光度计：吸光单位为 20 时约为 1mg/ml DNA 。

 

 

DNA 5’ 末端脱磷酸

1． 取纯化的细胞 DNA 10 μ g ，然后加入： 10 × CIP 2 μ l （ 1U ），双蒸水加至 50 μ l 。

2． 37 ℃水浴 2h 。

3． 90 ℃水浴 5min 以灭活 CIP 。

4． 用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。

 

 

DNA 5’ 末端 ³² P 标记

1． 将脱磷酸样品 DNA 置冰浴上，再加双蒸水 10 μ l ， 10 ×缓冲液 2 μ l ， T4 多核苷酸激酶 10U ， ³² P-ATP 740kBq （ 20 μ Ci ），双蒸水加至 20 μ l 。

2． 混合后， 37 ℃水浴 60min 。

3． 加入 1 μ l 的 0.5mol/L EDTA ， 90 ℃灭活 5min 。

 

 

观测

1． 取一定量的标记 DNA 稀释后在 1.8 ％琼脂糖凝胶上点样， 50V 电泳约 2h 。

2． 电泳后的凝胶置滤纸上烘干，进行放射自显影。

3． 含 ³² P 标记 DNA 电泳干凝胶进行同位素液闪测定，计算放射活性。

二、原位末端标记技术

 

  1 ） DNA 聚合酶或 Klenow 大片段介导的原位缺口平移（ ISNT ）

 

1． 切片常规脱蜡，梯度乙醇复水化。

2． 将切片组织浸入 2 × SSC 液中， 80 ℃， 20min ，然后蒸馏水冲尽。

3． 0.5 ％胃蛋白酶（ pH2.0 ） 37 ℃消化 0 ～ 20min ， PBS 洗尽。

4． 用滤纸擦干组织块周边液体放入湿盒组织切片上滴加缓冲液 A ， 5min 。缓冲液 A ： 50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L MgCl₂ , 10mmol/L β - 巯基乙醇， 0.005 ％ BSA ， pH7.5 。

5． 弃去缓冲液 A ，滴加标记液约 50 μ l ， 25 ℃温育 1h 。标记反应液： 0.005mmol/L dNTP, 0.005mol/L biotin-16-dUTP, 25U/ml Klenow 大片段。

6． PBS 漂洗 2 次，各 3min 。

7． 内源酶阻断剂阻断 15min 。

8． PBS 洗 2 次，各 3min 。

9． 滴加 HRP-avidin 覆盖组织，室温下 30min 。

10．  PBS 洗 2 次，各 3min 。

11．  DAB-H₂ O₂ 显色约 5min 。

12．  流水冲洗后，苏木素复染 1min 。常规脱水，透明，封片。

13．  阴性对照片在第 5 步改加不含 Klenow 的标记液，余同。

 

 

2 ） TdT 介导的 dUTP 缺口末端标记技术（ TUNEL ）

 

1． 切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行。

2． 3 ％的 H₂ O₂ 阻断内源性辣根过氧化物酶 30min 。

3． 0.15mol/L 的 PBS 洗 2 次，每次 5min 。

4． 切片浸泡在 2 × SSC 80 ℃ 20min 。

5． 0.15mol/L 的 PBS 洗 2 次，每次 5min 。

6． 蛋白酶 K 或胃蛋白酶消化 0 ～ 20min 。

7． 0.15mol/L 的 PBS 洗 2 次，每次 5min 。

8． TdT 缓冲液孵育 10min 。

9． TdT 反应液 37 ℃孵育 1h 。

10．  切片浸泡在 2 × SSC 溶液 10min ，以终止反应。

11．  0.15mol/L 的 PBS 洗 2 次，每次 5min 。

12．  链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育 30min 。

13．  0.15mol/L 的 PBS 洗 2 次，每次 5min 。

14．  0.04 ％的 DAB 显色 5 ～ 10min ，镜下控制时间。

15．  苏木素复染 3 ～ 5min ，常规复水，透明和封片。