细胞凋亡检测：生化特征的检测方法

根据调亡的生化特征的检测方法

一、琼脂糖凝胶电泳

1）常规的琼脂糖凝胶电泳

方法一：

1．收集细胞（5×106）1000r/min，离心5min，去上清。

2．PBS洗一次，1000r/min，离心5min，去上清。

3．加细胞核裂解液500μl重悬细胞，50℃水浴，3～5h，不时振摇或37℃过夜。

4．加0.5ml平衡酚抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。

5．上清移至另一Ep管，加0.5ml氯仿：异戊醇抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。

6．上清移至另一Ep管，加50μl的3mol/L乙酸钠和2ml预冷无水乙醇，上下颠倒几次混匀，可见絮状白色沉淀物。

7．置液氮5～10min，12 000r/min离心10min沉淀DNA，去上清，真空抽干或风扇下吹干残存液体。

8．加50～100μl TE缓冲液，另加5μl RNase，37℃水浴30min。

9．取20μl加上样缓冲液2～5μl，1％琼脂糖凝胶电泳（电压50V，1.5～2h），UV下观察。

方法二：

1．离心收集细胞（5×106），PBS（无Ca2＋和Mg2＋）洗1～2次。

2．0.5ml TBE溶液重悬，37℃孵育30min。

3．1mg/ml蛋白酶K 37℃处理30min。

4．加入上样缓冲液0.1ml。

5．25μl上样，1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，2V/cm 6h。

方法三：

1．收集细胞悬液（106细胞），低速离心（1000r/min，离心5min）。

2．去上清，沉淀加0.4ml低渗缓冲液作用1h。

3．13 000r/min，离心10min，将上清转移至另一Eppendorf管中，加等量50％异丙醇和0.5mol/L NaCl混匀，置液氮5min。

4．12 000r/min，离心10min，弃上清，沉淀真空抽干。

5．加TE 100μl，65℃加热10min，取20μl，加1～2μl上样缓冲液，电泳观察。

方法四：

1．收集细胞，1000r/min离心5min，去上清。

2．用冰预冷的70％乙醇固定，可长期保存于－20℃冰箱。

3．1000r/min离心5min，去除固定液，用约0.5ml的PBS重悬细胞。

4．转入Eppendorf管中，同法离心，去上清。

5．细胞用40μl PC缓冲液重悬，室温30～60min。

6．1000r/min离心5min，吸上清于新的Eppendorf管中，真空浓缩15min。

7．加入0.25％ NP-40溶液3μl，1mg/ml RNase A溶液3μl，37℃，30min。

8．加入3μl蛋白酶K，37℃，30min。

9．加入12μl样品稀释液，含溴化乙锭的1.5％琼脂糖电泳，观察。

2）琼脂糖凝胶电泳的定量检测

简易末端标记法

1．按常规提取细胞DNA。
　　2．在0.5ml的EP管中加入细胞DNA，反应体系如下：细胞DNA 0.5～1.0μg，10×缓冲液2μl，32P-dATP（或-dCTP）0.5μCi，Klenow聚合酶5U，双蒸水加至20μl。
　　3．混匀后稍加离心，室温反应30min。
　　4．加1μl 0.5mol EDTA终止反应。
　　5．常规酚/氯仿/异戊醇抽提1次，无水乙醇沉淀DNA，真空抽干。
　　6．溶于20μl的TE缓冲液中。
　　7．取标记DNA在1.8％琼脂糖凝胶上点样，50V电泳约2h。
　　8．电泳后的凝集置滤纸上烘干，进行放射自显影。
 
5’末端32P标记法

细胞DNA的提取

1．细胞悬液离心后，沉淀加消化缓冲液0.5ml，50℃ 3～5h，或37℃过夜。
　　2．用等体积的酚：氯仿：异戊醇抽提细胞裂解液。
　　3．将水相转移至新的试管，加入150mmol/L乙酸钠和10mmol/L氯化镁。
　　4．加入2倍体积的预冷无水乙醇，置液氮5min或－20℃ 12h。
　　5．12 000r/min离心沉淀DNA，70％乙醇洗1次后，真空抽干。
　　6．溶于20μl的TE缓冲液中。
　　7．加入终浓度为10μg/ml RNase，37℃，30min。
　　8．同法用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。
　　9．溶液20μl的TE缓冲液中，－20℃保存备用。DNA含量测定：用260nm波长紫外分光光度计：吸光单位为20时约为1mg/ml DNA。 

DNA 5’末端脱磷酸

1．取纯化的细胞DNA 10μg，然后加入：10×CIP 2μl（1U），双蒸水加至50μl。
　　2．37℃水浴2h。
　　3．90℃水浴5min以灭活CIP。
　　4．用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提，乙醇沉淀，真空抽干。

DNA 5’末端32P标记

1．将脱磷酸样品DNA置冰浴上，再加双蒸水10μl，10×缓冲液2μl，T4多核苷酸激酶10U，32P-ATP 740kBq（20μCi），双蒸水加至20μl。
　　2．混合后，37℃水浴60min。
　　3．加入1μl的0.5mol/L EDTA，90℃灭活5min。

观测

1．取一定量的标记DNA稀释后在1.8％琼脂糖凝胶上点样，50V电泳约2h。
　　2．电泳后的凝胶置滤纸上烘干，进行放射自显影。
　　3．含32P标记DNA电泳干凝胶进行同位素液闪测定，计算放射活性。

二、原位末端标记技术 

 1）DNA聚合酶或Klenow大片段介导的原位缺口平移（ISNT）

1．切片常规脱蜡，梯度乙醇复水化。
　　2．将切片组织浸入2×SSC液中，80℃，20min，然后蒸馏水冲尽。
　　3．0.5％胃蛋白酶（pH2.0）37℃消化0～20min，PBS洗尽。
　　4．用滤纸擦干组织块周边液体放入湿盒组织切片上滴加缓冲液A，5min。缓冲液A：50mmol/L Tris-HCl, 5mmol/L MgCl2, 10mmol/L β-巯基乙醇，0.005％BSA，pH7.5。
　　5．弃去缓冲液A，滴加标记液约50μl，25℃温育1h。标记反应液：0.005mmol/L dNTP, 0.005mol/L biotin-16-dUTP, 25U/ml Klenow大片段。
　　6．PBS漂洗2次，各3min。
　　7．内源酶阻断剂阻断15min。
　　8．PBS洗2次，各3min。
　　9．滴加HRP-avidin覆盖组织，室温下30min。
　　10．  PBS洗2次，各3min。
　　11．  DAB-H2O2显色约5min。
　　12．  流水冲洗后，苏木素复染1min。常规脱水，透明，封片。
　　13．  阴性对照片在第5步改加不含Klenow的标记液，余同。 

2）TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）

1．切片常规脱蜡，复水，后续过程在湿盒内进行。
　　2．3％的H2O2阻断内源性辣根过氧化物酶30min。
　　3．0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
　　4．切片浸泡在2×SSC 80℃ 20min。
　　5．0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
　　6．蛋白酶K或胃蛋白酶消化0～20min。
　　7．0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
　　8．TdT缓冲液孵育10min。
　　9．TdT反应液37℃孵育1h。
　　10．  切片浸泡在2×SSC溶液10min，以终止反应。
　　11．  0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
　　12．  链卵白素标记的辣根过氧化物酶孵育30min。
　　13．  0.15mol/L的PBS洗2次，每次5min。
　　14．  0.04％的DAB显色5～10min，镜下控制时间。
　　15．  苏木素复染3～5min，常规复水，透明和封片。