细胞凋亡检测：生化特征的检测方法

根据调亡的生化特征的检测方法

一、琼脂糖凝胶电泳

1）常规的琼脂糖凝胶电泳

方法一：

1．收集细胞（5×106）1000r/min，离心5min，去上清。

2．PBS洗一次，1000r/min，离心5min，去上清。

3．加细胞核裂解液500μl重悬细胞，50℃水浴，3～5h，不时振摇或37℃过夜。

4．加0.5ml平衡酚抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。

5．上清移至另一Ep管，加0.5ml氯仿：异戊醇抽提，上下颠倒几次混匀，6000r/min，离心5min。

6．上清移至另一Ep管，加50μl的3mol/L乙酸钠和2ml预冷无水乙醇，上下颠倒几次混匀，可见絮状白色沉淀物。

7．置液氮5～10min，12 000r/min离心10min沉淀DNA，去上清，真空抽干或风扇下吹干残存液体。

8．加50～100μl TE缓冲液，另加5μl RNase，37℃水浴30min。

9．取20μl加上样缓冲液2～5μl，1％琼脂糖凝胶电泳（电压50V，1.5～2h），UV下观察。

方法二：

1．离心收集细胞（5×106），PBS（无Ca2＋和Mg2＋）洗1～2次。

2．0.5ml TBE溶液重悬，37℃孵育30min。

3．1mg/ml蛋白酶K 37℃处理30min。

4．加入上样缓冲液0.1ml。

5．25μl上样，1.5％的琼脂糖凝胶上电泳，2V/cm 6h。

方法三：

1．收集细胞悬液（106细胞），低速离心（1000r/min，离心5min）。

2．去上清，沉淀加0.4ml低渗缓冲液作用1h。

3．13 000r/min，离心10min，将上清转移至另一Eppendorf管中，加等量50％异丙醇和0.5mol/L NaCl混匀，置液氮5min。

4．12 000r/min，离心10min，弃上清，沉淀真空抽干。

5．加TE 100μl，65℃加热10min，取20μl，加1～2μl上样缓冲液，电泳观察。

方法四：

1．收集细胞，1000r/min离心5min，去上清。

2．用冰预冷的70％乙醇固定，可长期保存于－20℃冰箱。

3．1000r/min离心5min，去除固定液，用约0.5ml的PBS重悬细胞。

4．转入Eppendorf管中，同法离心，去上清。

5．细胞用40μl PC缓冲液重悬，室温30～60min。

6．1000r/min离心5min，吸上清于新的Eppendorf管中，真空浓缩15min。

7．加入0.25％ NP-40溶液3μl，1mg/ml RNase A溶液3μl，37℃，30min。

8．加入3μl蛋白酶K，37℃，30min。

9．加入12μl样品稀释液，含溴化乙锭的1.5％琼脂糖电泳，观察。