肺泡2型细胞的分离培养

1、  称体重：
2、  腹腔内注射苯巴比妥钠50ｍｇ/kg将大鼠处死,用酒精严格消毒大鼠下颌至全腹皮肤及鼠毛,剪开下颌至中腹部皮肤,打开腹腔,推开肝脏并分离出肝及膈肌间的下腔静脉并给予切开放血。
3、  肺血管灌洗：分离并部分横断切开气管,插入连接有10ｍｌ注射器(内装ｐＨ7.0ＰＢＳ)的灌洗管并用细线加以固定,在固定的离心段剪断气管,剪开肋骨并打开胸腔将肺和心脏提出胸腔。用20号针(另一端连接20ｍｌ的注射器)穿刺进入右心室并顺着右心室插入到肺动脉进行肺血管的灌洗。直至左心房流出清亮液体，将肺和心脏、气管一起取下，灌洗成功的肺呈苍白色。
4、  肺印片：革兰氏染色、改良GMS染色,
5、  支气管灌洗：通过注射器行支气管肺泡灌洗,每次灌洗10ｍｌ,连续7～8次,回收40～50ｍｌ支气管肺泡灌洗液(ｂｒｏｃｈｉａｌａｌｏｖｅｏｌａｒｌａｖａｇｅｆｌｕｉｄｓ,ＢＡＬＦｓ)。将BALFs离心30min(2000r/m),弃上清再混匀沉淀物，加入DMEM移入培养瓶中培养。
6、  取不同断面的肺组织，甲醛固定，留作切片。
7、  胰酶消化：经气管注入胰酶15ml，37度水浴，消化20分钟，间隔10min补加胰酶10ml.。将肺在2ml DNase中剪碎，，摇床重震荡5-10分钟， 100目――――200目过滤，用显微镜观察消化情况，加5ml 血清中止消化，4度，1000r/ml离心10分钟，3mlDMEM悬浮细胞。Percoll梯度离心，DMEM洗，培养。