EB病毒诱导淋巴细胞永生化实验方法

实验步骤：

1.  EB病毒液的制备
  复苏B95.8细胞株，使用培养基为10% FCS RPMI-1640
  逐步添加培养基至细胞长至对数生长期
  细胞计数，调节细胞数量为1×106个/ml
  在CO2培养箱中继续续培养10天，中间不换液
  至第10天收集培养上清，1800rpm，4℃离心15分钟
  0.22μm滤器过滤，1ml/支分装，冻存于液氮备用

2.  病人外周血液的采集、分离

  使用枸橼酸钠抗凝管采集恢复期病人外周血10ml，尽量在24h内进行分离

  平衡盐(BSS, balanced salt solution)溶液配制(请具体参见淋巴细胞分离液使用说明)：

Solution A
Anhydrous D-glucose 0.1 percent 1.0 g/l
CaCl2 × 2H2O 5.0 × 10-5 M 0.0074 g/l
MgCl2 × 6H2O 9.8 × 10-4 M 0.1992 g/l
KCl 5.4 × 10-3 M 0.4026 g/l
TRIS 0.145 M 17.565 g/l
Dissolve in approximately 950 ml distilled water and add
10 N HCl until pH is 7.6 before adjusting the volume to 1 litre.
Solution B
NaCl 0.14 M 8.19 g/l

~undefinedTo prepare the BSS mix 1 volume SolutionA with 9 volumes solution B. Prepare the solution fresh each week. Other standard salt solutions may be used.

①  取病人外周血4ml+4mlBSS，混匀
②  各取4ml缓慢加入含有3ml淋巴细胞分离液Ficoll PLUS-Paque（GE Healthcare Bio-Sciences货号:71716700,使用前，充分混匀）的10ml离心管中（分两管进行）
③  400g，18℃，离心30min
④  小心吸取上层血浆，保存备用，避免扰动细胞。
⑤  小心吸取淋巴细胞层至新的15ml离心管中
⑥  加入6mlBSS，以吸管轻轻重悬细胞
⑦  100g，18℃，离心10min，弃上清
⑧  以8mlBSS再次洗涤一遍，离心，弃上清（重悬同时进行细胞计数）
(一般1ml血能分离出1×10^6个细胞，故4ml血约有4×10^6个细胞)

3.  EB病毒转化淋巴细胞

①  取EBV上清1ml重悬上述细胞，37℃水浴，2h，20min晃动一次
②  加入3ml 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A （环孢素A Sigma Product No. C1832 ）
③  分两孔，2ml/孔加至24孔板中（如果分离的血量大，请酌情考虑加入25cm2培养瓶中培养），37℃，5％CO2培养
④  一般24h后即可见到细胞聚集成团生长，3-5天可见液体PH值发生变化，呈橙黄色，早期视情况补液，待细胞生长良好再采用半量换液（培养基为3ml 20％FBS-1640全培，含0.2 μg/ml cyclosporin A）
⑤  一般15天左右即可建立稳定生长的淋巴母细胞。


经验总结及注意事项：

EB病毒的相关操作及生物安全防护，请参照附件一
环孢素A容易吸附在容器上，请配成高浓度贮液，工作液尽量现配现用。
EB病毒液请按照上述方法制备，保证高的病毒滴度，不可4℃存放！！！
外周血尽量新鲜采集，并保证无菌，推荐使用枸橼酸钠抗凝管！！！
进行EB病毒感染永生化的细胞不要少于1×10^6，少于该数会影响成功率。