用端粒酶诱导人类间充质干细胞永生化

1. 从动物或人组织中提取的细胞，在体外培养中，细胞会有不同程度的分裂增殖，称为增殖性衰老 。但是有些细胞在自发或其他条件诱导下可突破增殖性衰老，拥有无限增殖的能力，成为永生化细胞，骨髓来源的间充质干细胞属于多能干细胞，可作为组织工程种子细胞的来源。

2. 端粒酶对染色体的稳定性及决定细胞生命周期起极其重要的作用。端粒酶或末端转移酶是由两个主要的亚单位构成：RNA成分（hTR）和蛋白质分解亚单位（hTERT），RNA（hTR）亚单位普遍表达于正常和肿瘤组织中，而蛋白质分解亚单位（hTERT）仅在肿瘤细胞、生殖谱系细胞及激活的淋巴细胞中表达。

3.  细胞衰老机制现在管遍接受的是细胞衰老两阶段模型-M1/M2模型，细胞在生长过程中，经过多次分裂后，在肿瘤抑制因于p53和pRb等作用下，细胞对生长因子的反应消失，出先有丝分裂反应的消失，DNA合成抑制蛋白的产生。DNA合成停止，细胞不可逆的停滞于G1期，发生衰老（sesence. M期），细胞发生凋亡或死亡，永生化指的是在体外培养的细胞自发的或受外界影响从增殖衰老中逃离，从而具有无限增殖能力的过程。

材料
无菌

生长培养基：含高浓度葡萄糖（4.5 g/L）的 Dulbecco's modifiled Eagle's 培养液（DMEM），添加 L-谷酰胺 2 mmol/L、10% 胎牛血清、100U/mL 青霉素及 100 ug/mL 链霉素

聚凝胺： 8 mg/mL
普通容器 ：培养瓶 25 cm²，75 cm²

反转录酶病毒载体的产生用材料
细胞系:
PG13
GP+E-86
反转录病毒载体 GCsam hTERT
转染用 htrt DNA
Tx 缓冲液 ：总量 20 mL，含有以下物质：

HEPES 0.5mol/L，pH 7.1   200uL
NaCl，5rnol/L   100uL
Na2 HPO4/NaH2PO4，1mol/L   3uL
UPW   1.7 mL

缓冲液 A：总量 20.04 mL，含有以下物质：

NaCl（5mol/L）   600uL
EDTA（0.5mol/L）40uL
Tris-HCl，pH7.5（0.5mol/L）400uL
UPW   19 mL

hMSC（人间充质干细胞）细胞的转导用材料
hMSC（人间充质干细胞）细胞
培养瓶 75 cm²
多孔板 6 孔
转导后用材料
用于冷冻保存的实验材料（见方案 20.1）
用于 DNA 指纹分析 (见方案 16.8) 或 DNA 图谱分析（见方案 16.9）或其他验证分析方法的实验材料（如方案 16.10）

PCR 试剂
DNA 100 ug/mL
10x PCR 缓冲液 L（含 Mg²⁺）
正向引物（2umol/L）
反义引物（2umol/L）
dNTP 混合物（10 mmol/L）
DNA 聚合酶
UPW

操作步骤
反转录酶病毒载体的产生
具有 hTERT 基因的反转录酶病毒载体通过两个步骤包装进入长臂猿白血病病毒（GALV）包装的细胞系 PG13。首先，使用 20 ug/mL htrtDNA（Geron）转染包装细胞系 GP+E-86，然后用上清液感染 PG13 细胞。

1. 6.7x105 GP+E-86 细胞系接种在一个小培养瓶（25 cm²）中。

2.GP+E-86 细胞系的转染
（a）将 280uL Tx 缓冲液加人每个管中（常用容器）。
（b）制备 DNA 管：

组成名称    DNA 浓度   15 ug DNA      缓冲液 A       CaCl₂ 2.5mol/L     总量
                       undefinedug/uL       undefineduL            280-30-X                  30                280

~undefined X x Z = 15 ug

（c）将 Tx 缓冲液逐滴加人含有 DNA 溶液的管内，轻轻地混合。
（d）在室温下孵育 30℃，使其产生沉淀。
（e）在每个含有 GP-E-86 细胞的 25 cm2 培养瓶中，加入 5 mL 新鲜培养液。
（f）轻轻加入混合液（Tx+DNA）至 GP+E-86 细胞，在 37℃ 孵育 4-6 h。
（g）在 25 cm² 培养瓶内，用 D-PBSA 小心地洗三次。
（h）加新鲜培养液至细胞中，在 37℃ 孵育过夜。

3. 更换细胞培养液，加 2 mL 新鲜培养液 (取代以前 5 mL 培养液)，以产生病毒。

4. 在进行第三步的同一天，将 1x10⁴个 PG13 细胞接种于 6 孔板的每个孔中。

5. 次日，从感染的 GP-E-86 细胞收获其上清液，加入最终浓度为 8 ug/mL 的多聚胺 (如 1 ug/mL 上清液)。

6. 用孔径 0.45 um 滤膜过滤上清液，将 2 mL 过滤液加至含 GP-E-86 细胞的每个孔中。

7. 在 32℃ 1000 g 离心培养板。

8. 在 37℃ 孵育过夜。

9. 次日，更换细胞的培养液。

hMSC 细胞的转导
1. 将 2x10⁶ PG13 细胞种人 75 cm2 培养瓶中。

2. 次日，将 6 mL 新鲜培养液加至 PG13 细胞中。

3. 第三日，将 hMSC 细胞（约 2.5x10⁴~7.5x10⁴ 个）加至 6 孔板中，用于转导。

4. 从包装的细胞收获上清液，加入最终浓度为 8 ug/mL 的多聚胺，用孔径 0.45 um 的滤膜过滤上清液。

5. 将 2 mL 过滤后的反转录病毒上清液加入 6 孔板的每个孔中。

6. 在 32℃ 1000 g 离心培养板，37℃ 孵育过夜。

7. 吸去逆转录病毒上清液，加入新鲜培养基。

转导后培养物的处理
1. 经过 10~12 次传代接种，未接受 hTERT 基因的细胞将死亡，剩余的细胞 则肯定已插入 hTERT 基因，具有 hTERT 基因的细胞将在传代过程中被选择出来。

2. 建议将细胞分装在安瓿中冷冻保存，建立一个转导细胞的贮备库，这些转导细胞处于不同的群体倍增（PI）水平（可与 PD 生长曲线相匹配）。这样做也可节省时间，因为如果发生污染就要丢弃培养的细胞，重新开始。

3. 在梅次传代培养时，用下列公式获得 PD，以建立 PD 生长曲线。

公式中的 PD 代表种群倍增的次数，In 是自然对数 Nstart 是细胞初始接种量，Nfinish 是细胞在传代培养过程中所获得的全部细胞数。
例 1，如果最初种入 2x10⁵个细胞，培养后增加至 3.2x10⁶个细胞，则：

如果按 1:4 的细胞量进行传代培养，则每次传代培养后的 Nfinish 将乘以 4。所以在上述例子中，假设有 10 次传代培养，Nfinish 就是（3.2x10⁶）x4 的 10 倍，也就是 3.4x10¹²。

例 2，如果最初种入 2x10⁵ 个细胞，培养后可增加至 3.2x10⁶个细胞。以 1:4 的细胞址传代培养 10 次，则：

4. 在建立永生细胞系之后，必须检查其真实性，以确保其来源于最初的材料， 而不是由于交叉污染从实验室其他永生细胞系衍生而来（见 19.5 节）。这是能做到的，例如针对转移基因（hTERT）（见下）的 PCR 检测、DNA 指纹检 测（见方案 16. 8）或 DNA 图谱检测（见方案 16.9）。

hTERT 的 PCR
1. 溶解 PCR 试剂并保存在冰块中 

2. 对下列试剂进行仔细的混合，记住，一定要包括阳性对照（其他 hTERT 阳 性标本）和阴性对照（无 DNA 模板）
DNA1uL（100ng）   100 ug/mL
10xPCR 缓冲液（含Mg²⁺）   2uL

正义引物   2uL
反义引物   2uL
dNTP 混合物（10 mmol/L）   0.4uL
DNA 多聚酶   0.1uL
UPW   12.5uL
最终体积为 20 mL（包括 DNA）

3. 将管子置于 PCR 仪器中，按以下步骤进行操作：90℃，3 min，首先进行变性作用；94℃，30s，再次进行变性作用；59℃，39s，进行复性；74 ℃，1 min，进行延伸；如此循环 30 个周期，然后是 74℃，1 min。

4. 将 PCR 产物在 1.5%~2% 琼脂糖凝胶中进行电泳。

1. 将细胞分装在安瓿中冷冻保存，建立一个转导细胞的贮备库，这些转导细胞处于不同的群体倍增（PI）水平（可与 PD 生长曲线相匹配）。这样做也可节省时间，因为如果发生污染就要丢弃培养的细胞，重新开始。   
   

   
   

2. 在建立永生细胞系之后，必须检查其真实性，以确保其来源于最初的材料， 而不是由于交叉污染从实验室其他永生细胞系衍生而来。