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EB病毒诱导淋巴细胞永生化实验方法

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实验步骤:

1.  EB病毒液的制备
  复苏B95.8细胞株,使用培养基为10% FCS RPMI-1640
  逐步添加培养基至细胞长至对数生长期
  细胞计数,调节细胞数量为1×106个/ml
  在CO2培养箱中继续续培养10天,中间不换液
  至第10天收集培养上清,1800rpm,4℃离心15分钟
  0.22μm滤器过滤,1ml/支分装,冻存于液氮备用

2.  病人外周血液的采集、分离

  使用枸橼酸钠抗凝管采集恢复期病人外周血10ml,尽量在24h内进行分离

  平衡盐(BSS, balanced salt solution)溶液配制(请具体参见淋巴细胞分离液使用说明):

Solution A
Anhydrous D-glucose 0.1 percent 1.0 g/l
CaCl2 × 2H2O 5.0 × 10-5 M 0.0074 g/l
MgCl2 × 6H2O 9.8 × 10-4 M 0.1992 g/l
KCl 5.4 × 10-3 M 0.4026 g/l
TRIS 0.145 M 17.565 g/l
Dissolve in approximately 950 ml distilled water and add
10 N HCl until pH is 7.6 before adjusting the volume to 1 litre.
Solution B
NaCl 0.14 M 8.19 g/l

~undefinedTo prepare the BSS mix 1 volume SolutionA with 9 volumes solution B. Prepare the solution fresh each week. Other standard salt solutions may be used.

①  取病人外周血4ml+4mlBSS,混匀
②  各取4ml缓慢加入含有3ml淋巴细胞分离液Ficoll PLUS-Paque(GE Healthcare Bio-Sciences货号:71716700,使用前,充分混匀)的10ml离心管中(分两管进行)
③  400g,18℃,离心30min
④  小心吸取上层血浆,保存备用,避免扰动细胞。
⑤  小心吸取淋巴细胞层至新的15ml离心管中
⑥  加入6mlBSS,以吸管轻轻重悬细胞
⑦  100g,18℃,离心10min,弃上清
⑧  以8mlBSS再次洗涤一遍,离心,弃上清(重悬同时进行细胞计数)
(一般1ml血能分离出1×10^6个细胞,故4ml血约有4×10^6个细胞)

3.  EB病毒转化淋巴细胞

①  取EBV上清1ml重悬上述细胞,37℃水浴,2h,20min晃动一次
②  加入3ml 20%FBS-1640全培,含0.2 μg/ml cyclosporin A (环孢素A Sigma Product No. C1832 )
③  分两孔,2ml/孔加至24孔板中(如果分离的血量大,请酌情考虑加入25cm2培养瓶中培养),37℃,5%CO2培养
④  一般24h后即可见到细胞聚集成团生长,3-5天可见液体PH值发生变化,呈橙黄色,早期视情况补液,待细胞生长良好再采用半量换液(培养基为3ml 20%FBS-1640全培,含0.2 μg/ml cyclosporin A)
⑤  一般15天左右即可建立稳定生长的淋巴母细胞。


经验总结及注意事项:

EB病毒的相关操作及生物安全防护,请参照附件一
环孢素A容易吸附在容器上,请配成高浓度贮液,工作液尽量现配现用。
EB病毒液请按照上述方法制备,保证高的病毒滴度,不可4℃存放!!!
外周血尽量新鲜采集,并保证无菌,推荐使用枸橼酸钠抗凝管!!!
进行EB病毒感染永生化的细胞不要少于1×10^6,少于该数会影响成功率。



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