血小板活化检测方法

1 ． 临床意义

 

心肌梗塞、脑血管血栓形成、深静脉血栓形成、脑栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在中国有很高的发病率，也是致死的重要原因。血小板活化是血栓形成的重要环节，检测血小板的活化状态可辅助诊断和监控血栓性疾病，对判断血栓前状态意义也非常重大。

2 ． 检测原理

 

静止状态的血小板内分布着多种颗粒，如 a 颗粒、溶酶体颗粒等。这些颗粒表面存在着一些特定蛋白，如 a 颗粒表面有 CD62p 抗原，溶酶体颗粒表面有 CD63 抗原。血小板活化时，由于颗粒膜蛋白与血小板膜蛋白相互融合，使颗粒膜蛋白翻转到血小板膜表面。因此，可通过检测这些颗粒膜蛋白来判断血小板的活化状态。

3. 采血

 

EDTA 抗凝采血，取后段血。因前段血中可能有组织液存在，造成人为血小板活化。

4. 试剂选择

 

FITC 标记的 CD42b 抗体
PE 标记的 CD62p 或 CD63 抗体
在血小板膜表面稳定表达的抗原有 CD41/CD61(GPIIb/IIIa) 和 CD42a, CD42b 等，这些抗原均可作为血小板的标志。但因中国存在着一部分血小板无力症患者，其血小板表面缺乏 CD41/CD61(GPIIb/IIIa) 。因此，一般使用 CD42b 来鉴别血小板。
因一般情况下， CD62p 和 CD63 的表达率均较低，需用 PE 等荧光较强的荧光素标记检测。

5. 染色

 

a. 全血法：

1) 取试管 A( 阴性对照 ) 和试管 B( 测定管 ) ，均加入 5ml 抗凝全血和 200ml PBS
2) A 管中加入适量的 CD42b-FITC 和阴性对照抗体 ( 对应于 CD62-PE 或 CD63-PE)
   B 管中加入适量的 CD42b-FITC 和 CD62-PE 或 CD63-PE 抗体
3) 室温，避光孵育 25 分钟
4) 加 2 ml PBS ，上机检测
血小板在体外随着时间的延长会自发活化，所以由采血到检测一般要在 3 小时内完成 。

b. 固定法：

1)  抗凝全血 800rpm 离心 10 分钟，取上清液即 PRP( 富血小板血浆 )
2)   以等体积 1-2% 的多聚甲醛固定 10 分钟
3)   PBS 洗涤 1 次，用 PBS 调节细胞浓度为 1 × 10⁷ 个 /ml 左右
4)   分别在试管 A( 阴性对照 ) 和试管 B( 测定管 ) 进入 100ml 血小板悬液
5)   A 管中加入适量的 CD42b-FITC 和阴性对照抗体 ( 对应于 CD62-PE 或 CD63-PE)
     B 管中加入适量的 CD42b-FITC 和 CD62-PE 或 CD63-PE 抗体
6)   其余步骤同全血法
固定法可避免血小板在体外因时间或操作造成的人为活化，固定后的血小板可在 5 天内检测。

 

而固定法的步骤较为繁琐，耗费时间，且在制备 PRP 时需离心，容易带来人为活化。所以很多实验室还是倾向于全血法。但是如果采血后不能立即检测 (3 小时内 ) ，则需用固定法。

6. 分析

 

1)           用 CD42b 表达量和侧向散射光设门来选定血小板

 

选定血小板过去常用的方法是 FS(C)/SS(C) 设门，根据细胞的大小与颗粒度来确定血小板。然而血小板的大小不一，有些血小板较大，容易与红细胞相混淆，尤其当活化时，血小板与白细胞发生粘附，在 FS(C)/SS(C) 图上进入白细胞群，使得一部分血小板丢失，因此应用该法对血小板进行选定不够准确。

 

目前公认的方法是用血小板特异性标志来选定血小板，因无论血小板大小，无论其是否活化，均稳定表达 CD41/CD61(GPIIb/IIIa) 和 CD42a 等，因此可以非常精确地区分血小板。

 

2) 做阴性对照管，调节阳性区的假阳性率为 1-2%
3) 做测试管，得出 CD62p 的表达率，及血小板活化的百分率 .