细胞介导的细胞毒作用（CMC）检测法：细胞的制备

CMC 中效应细胞的制备

 

1 ）用淋巴细胞分离液分离 PBMC

 

1． 抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中，加 2 倍量磷酸盐（ PBS ）悬浮细胞。将此悬液小心加在淋巴细胞分离液上， 400 × g 离心 30 分钟。

2． 离心后红细胞在管底， PBMC 在血浆和淋巴细胞分离液的交界面。收集 PBMC ，用 PBS 洗涤细胞两次，每次离心 150 × g 10 分钟。低速离心可以减少血小板沉淀，但细胞沉淀物较松散，去上清液时注意丢弃细胞。

3． 将细胞悬浮于含 2 ％～ 5 ％人 AB 血清的 RPMI-1640 培养液中，计数细胞，用 1 ％台盼蓝染色检测细胞活力（应 >90% ），再用同样培养液将细胞配成 1 × 10⁶ ～ 2 × 10⁶ /ml 。

 

 

2 ）分离大颗粒淋巴细胞

 

1． 配制不连续 Percoll 梯度：取 Percoll 原液与 10 倍浓缩的 PBS 以 9 ： 1 的比例混合，此时溶液为 100 ％ Percoll ，比重是 1.127 ，毫克分子渗透压浓度为 290mOsmol/kg 。将 100 ％ Percoll 与含 0.75 ％牛血清蛋白的 RPMI-1640 培养液混合配成 41.1 ％、 45.8 ％、 50.0 ％和 66.6 ％的 Percoll 溶液。在 41.4 ％和 50.0 ％ Percoll 溶液中加一滴 0.1 ％台盼蓝，以便区分个梯度溶液的交界面。

2． 在 50ml 离心管中从下向上依次小心加入 66.6 ％、 50.0 ％、 45.8 ％和 41.1 ％的 Percoll 溶液各 10ml ，使分别形成明显的交界面。再小心加水 10ml 约含 5 × 10⁸ PBMC 的细胞悬液。水平离心 500 × g 30 分钟。

3． 分别收集各交界面的细胞，用 RPMI-1640 培养液洗涤细胞 3 次，每次离心 500 × g 10 分钟。用含 2 ％～ 5 ％人 AB 血清的 RPMI-1640 培养液将细胞配成适当浓度。 LGL 的密度较低，主要在 41.4 ％和 45.8 ％的交界面。 50 ％和 66.6 ％交界面细胞主要是 T 细胞， 45.8 ％和 50 ％交界面细胞是 T 细胞和 LGL 的混合物。三个交界面中的细胞都有 LAK 活性。

 

 

3 ）其它来源的效应细胞

 

1． 无菌摘取胎儿胸腺、胎肝、胎脾或肿瘤的引流淋巴结，置含 2 ％～ 5 ％人 AB 血清的 RPMI-1640 培养液的平皿中。

2． 在无菌操作下，用注射器芯将上述器官挤压通过 200 目的钢丝网，得到单个细胞。用上述培养液洗涤细胞一次。

3． 将细胞悬浮于上述培养液中，计数细胞，用台盼蓝染色检测细胞活力（应 >80 ％），再用同样培养液将细胞配成 1 × 10⁶ ～ 2 × 10⁶ /ml 。

 

 

4 ） LAK 细胞的诱生和扩增

 

1． 向上述各种来源的淋巴细胞悬液中加重组 IL-2 到 1000U/ml 。以 2 × 10⁶ /ml 的细胞浓度，在 37 ℃ 5 ％ CO₂ 的饱和水汽二氧化碳培养箱中培养 3 ～ 5 天，细胞即具有 LAK 活性。

2． 培养 3 ～ 5 天的 LAK 细胞数量基本没有变化。如需较多的 LAK 细胞，可以继续培养至 2 ～ 3 周：每当细胞生长到 5 × 10⁶ ～ 10 × 10⁶ /ml 时分瓶，用同样培养液将细胞配成 1 × 10⁶ ～ 2 × 10⁶ /ml ，再加 IL-2 继续培养。

靶细胞的制备（分离肿瘤细胞和 TIL ）

 

1． 无菌摘取肿瘤，置预冷的含抗生素的 RPMI-1640 培养液中，剪去结缔组织，剪碎瘤体至 1 ～ 2mm 大小。放置 2 ～ 10 分钟让组织块沉淀，吸去上清液。

2． 将沉淀的组织块置 5 ～ 10 倍体积的消化液中， 37 ℃中搅拌或振荡 1 ～ 4 小时或室温过夜。用力吹打组织块，即可得到单个细胞悬液。

3． 离心 400 × g 10 分钟，除去消化液。用 5 倍体积的 RPMI-1640 培养液悬浮细胞。将细胞悬液小心加到双层淋巴细胞分离液上。

4． 离心 400 × g 30 分钟，上层分界面是新鲜肿瘤细胞，下层分界面是肿瘤组织中的淋巴细胞（ TIL ），可用于诱导杀伤活性和扩增。

5． 用 RPMI-1640 培养液洗涤肿瘤细胞两次，用作检测 LAK 细胞活性的靶细胞。此细胞可以在含 50 ％人 AB 血清和 10 ％二甲基亚砜（ DMSO ）的 RPMI-1640 培养液中以 1 × 10⁷ ～ 5 × 10⁷ /ml 的浓度置液氮中冻存，用前复苏。