小鼠骨髓细胞染色体标本制作[细胞遗传]

一、实验目的和要求
通过这一实验，要求学生了解哺乳动物染色体标本的制作方法，并对动物染色体进行观察。
二、实验原理
由于小鼠四肢骨内骨髓细胞中的造血干细胞是生成各种血细胞和原始细胞，具有高度的分裂能力，本实验采用这一材料，通过前处理，低渗，固定，制片，染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。
三、实验用品
1．材料：小白鼠
2．器具：注射器（1ml,5ml）、5号针头、解剖盘、解剖剪、镊子、玻璃吸管、10ml刻度的离心管、离心机、载玻片、盖玻片、显微镜、滤纸、擦镜纸、棉花、量筒、天平、恒温水浴锅
3．药品：0.01%秋水仙素、0.075MKCl、固定液（甲醇：冰醋酸=3：1）、Giemsa染液、0.01M磷酸缓冲液(PH6.8)，0.85%生理盐水。
四、实验步骤
1．预处理：实验前2.5-3小时，按每克体重注射0.02ml，给小白鼠腹腔注射秋水仙素。
2．断颈处死动物，解剖小鼠内生殖器官，鉴别雌雄性别。
3．剥取股骨，剔去肌肉组织，剪去两端的股骨头
4．冲洗骨髓：吸取0.6ml生理盐水,注射器针头插入股骨一端,反复冲洗骨髓到8ml的离心管中.
5．低渗：加入4.4ml0.075MKCl溶液,37oC水浴低渗40分钟，中间（约20分钟）用吸管吹打一次，使细胞分散，悬浮于溶液中。
6．离心：1000rpm离心10分钟后弃去上清液，离心之前加1ml固定液并用吸管轻轻吹匀，进行预固定。
7．固定I：沿管壁慢慢加入固定液5ml，用吸管吹打成细胞悬液后，室温下静置30分钟，15分钟时吹打一次。
8．离心：1000rpm离心10分钟，弃上清液。
9．固定II：同固定I。
10．离心：同8离心后加0.3-0.5ml固定液，吸管吹打成细胞悬液。
11．滴片：用吸管吸取细胞悬液，滴在预冷的载玻片上，在酒精灯火焰上微微加热，室温晾干
12．染色：10% Giemsa染液染色30分钟；
镜检：低倍―――高倍 。
五、注意事项
低渗与离心等步骤的操作要轻。
观察细胞的标准为：
1．细胞完整，轮廓清晰，染色体分布在同一水平面上。
2．染色体形态和分布良好。
3．最好无重叠，即使有个别重叠，也要能明确辩认，以免差错。
4．所观察的细胞处于同一有丝分裂阶段，即染色体螺旋化程度或染色体长短大致一样。
在所观察的细胞周围，没有离散的单个或多个染色体存在，以免影响计数。