CD34阳性细胞计数

外周血现已被广泛地被用作骨髓移植、癌症患者接受大剂量化疗或放疗后骨髓重建造所需血干细胞（ Hemotopoietic Progenitor Cells HPC ）的来源。外周血源性干细胞现主要被运用自体移植，其应用面也逐步拓展至异基因骨髓移植中。使用外周血替代骨髓作为造血干细胞的来源有着以下优点： 1 ，易采集； 2 ，对供者无需全身麻醉； 3 ，减少了采集后并发症的发生； 4 ，受者造血系统重建快； 5 ，费用低； 6 ，住院时间缩短或可部分或全部在门诊处完成操作。

相对于骨髓，外周血中的造血干细胞一般只出现一次高峰，其数量取决于供者血体积和 / 或单个核细胞的数量。由于外周血中造血干细胞含量很低，固常规中运用多极分离技术来收集这些细胞。在早期临床研究中，收集的干细胞作为移植物数量是否足够很不清楚。因为要检测这些细胞数量需要使用集落形成实验，但此法明显不适用于临床，因其大致需要 12-15 天时间出结果，故无法满足临床中当天出报告决定移植是否继续的要求。此问题自发现 CD34 抗体可鉴别造血干细胞，并成功地被运用流式细胞仪定量检测造血干细胞后被圆满解决了。

CD34+ 造血干细胞植活最低数量要求是 2-5 x 106/ 公斤体重。然而正常人外周血中干细胞数量只占所有有核细胞的 0.1% 。很明显这些数量的干细胞是不足够运用于移植的，除非使用恰当技术增加外周血干细胞的含量供采集。此技术可通过给予供者集落刺激因子（通常是粒或粒 - 单集落刺激因子），同时可联合骨髓抑制剂（如环磷酰胺）的方法动员造血干细胞进入循环外周血中。联合使用化疗药物与集落刺激因子造成短暂的循环血中髓系细胞抑制，随后使骨髓代偿性地释放髓祖细胞、造血干细胞至外周血，从而达到动员干细胞的目的。联合使用细胞毒药物与集落刺激因子可延长抑制时间，相对于单独使用集落刺激因子可增加动员至外周血中的干细胞。对于正常人供者不可使用化疗药物来抑制外周血，常使用 G 或 GM-CSF 、血小板刺激因子来动员。关于如何使用动员药物请参见其他相关文献。

 

早期外周干细胞计数

在尚未应用流式细胞仪定量检测 CD34+ 细胞时，外周血干细胞计数常运用单位 - 粒 / 巨噬细胞集落形成实验间接求得。这项检测技术通过直接计数干细胞形所的集落来反映干细胞的数量，故被认为是检测是否存干细胞的金标准。但也有学者置疑此检测是否与移植成活率有很好的相关性。因为在这项技术中，各研究单位缺乏统一的检测标准；刺激因子不同的处理方法和不同的配伍使用；集落形成后不同的计数方法都造成了统计数据具有很大的变异性。常规体外集落形成实验主要检测髓系祖细胞并要求大约 14 天取得结果，使得该项检测无法来确定临床何时采集干细胞；所以以前只根据循环血中的最大集落数（ CFU 而非 CFU-GM ）来确定采集多少细胞。

 

使用 CD34 识别造血干细胞

自从发现、纯化、标记抗 CD34 单克隆抗体开始，使流式细胞定量检测在外周血或骨髓中的 CD34 阳性造血干细胞成为了可能。 CD34 抗原存在于各种祖细胞上，其中包括多能干细胞和间质干细胞。在某些组织的上皮细胞上也有表达。 CD34 抗原的分子量为 105-120KD ，具有一个高度糖基化的类粘蛋白的结构。内皮细胞的 CD34 抗原与 L 选择素结合，然而造血干细胞上的 CD34 抗原的配体至今还未发现，有学者认为此抗原在细胞粘附中起作用。通过与不同特异性的 Vibrio cholera 神经氨酸苷酶和 Pasturella hemolytica 起源的糖蛋白酶作用可区分出此抗原的不同位点。这些位点根据其与不同的抗体结合情况可分为 I ， II 和 III 类，最近有报道 I 和 II 类抗原应属同一家族，因为它们具有相似的抗原结构和功能属性。这些研究都是基于交叉封闭实验的，故不可作为评价抗体结合效率或抗原空间结构之用。 II 类抗原位点具有由非糖基化氨基酸构成的线性申展结构，四周由在远 N 未端组成 CD34 的 I 抗原的类糖酶结构环绕。尽管 I 类与 II 类抗原几乎合二为一，但它们化学和物理性质是不同的．

　　 Siena 领导的工作组是第一个报道使用流式细胞仪定量检测 CD34+ 造血干细胞的含量，来决定动员干细胞及采集最佳时间，并研究 CD33 在干细胞上的表达与移植效果的相关性。 CD34 阳性细胞运用 SSC 与 CD34 双参数流式点图来检测。在此项研究中发现所有的 CD34 阳性细胞均与形成 CFU-CM 集落相关；并证实 CD34+ 细胞计数是决定干细胞采集时间有效方法。此外， Fritsch 及其工作组发现 CD34 阳性细胞比例与外周血单个核细胞数量和 CFU-GM 和 CFUGEMM 检测的集落形成能力有相关性。这些结果被其他学者相继证实，并使流细胞仪成为定量检测 CD34+ 细胞成为监测动员干细胞和计数移植中造血干细胞数量的有效、精确的工具。

尽管以前工作已证实造血干细胞表达 CD34 抗原，但鉴别多能干细胞的复杂工作才刚刚开始。 Siena 及其工作组发现 CD34+CD33+ 双阳性细胞数量与早期移植成功有相关性。同时 Tertappen 注意到骨髓中提取的 CD34+CD38- 阴性的细胞在 IL-3 ， IL-6 和 GM-CSF 刺激下能够形成最原始的集落；随着 CD38 抗原的增加， CD34 阳性细胞形成这种原始集落的能力下降。在 CD34+ 细胞中， CD34+CD38- 表型的细胞占 1.0% 左右。随后又发现了其他细胞表面抗原在识别多能干细胞中起着重要作用。对于绝大多数临床应用来说，计数 CD34 阳性细胞已足够为移植提供可靠、持久的参数。然而计数更为原始的多能干细胞能够提供其他重要的信息，所以有必要发展下面将叙述的技术来达成此目标。此外可发现、鉴别更新的一些干细胞抗体来提供更为直接的检测方案，如： ACC-133 和 F84.1 。

在达到一个稳定、长期的移植成功的疗效中， CD34+ 阳性细胞最少需求量方面还存在争议。 Bender 发现大约 2x106 CD34+ 细胞 / 公斤体重的剂量能够保证可靠的移植成功率。在许多病例中，这个剂量很容易从动员的病人或正常人中收集到。 Bensinger 及其工作组发现 CD34+ 阳性细胞与血小板、粒细胞重建时间有很强的相关性，并建议 CD34+ 细胞最佳剂量是 5x106/kg 。一个对 692 例自体移植病例研究也得出了相似的结论。

在移植前处理治疗中，病人的耐受性及用药的强度等因素会造成以上情况， Tricot 等观察 225 例接受 PBPC 移植的病例和经 PBPC 输入治疗了难治性骨髓瘤患者，发现以上因素使自体移植中 CD34+ 细胞的最佳剂量各不相同。此研究表明，对于移植前接受化疗少于 24 个月的病人，快速植活剂量应 >2.0 X 106 CD34+ 细胞 /kg ；对于长期接受全身化疗的病人（大于 24 人月）最低剂量则为 >5.0 X 106 CD34+ 细胞 /kg 。此处接受短期化疗的病人更容易、快速地取得 CD34+ 细胞。总而言之，这些研究表达 2-5 X 106 CD34+ 细胞 /kg 的剂量对于大多数情况下是足够的，但也有研究表明更高剂量的 CD34+ 细胞移植能够帮助病例更容易克服组织相容性问题。以下将要讨论有关 CD34+ 细胞的检测技术，有些推荐剂量之间的差异正是由于检测方案不同所引起的。

 

CD34 检测方案变异系数及其标准化

流式细胞 CD34 干细胞计数为成为应用广泛的实时检测 PBPC 是否足够移植的有效方法。对动员后供者循环外周血中 CD34+ 细胞绝对计数能够预测采集物中干细胞的数量，并越来越多地用来决定何时可开始采集干细胞。根据 CD34 阳性细胞在样本中的含量将决定是否继续给予生长因子刺激、采集是否继续。每次干细胞采集需要志愿者在护士的照顾下进行 3-4 个小时的干细胞分离过程，采集的细胞在体外需要进行特殊的处理或进行低温保存。从治疗时间及消耗资源的意义上来说，以上动员、采集过程的费用是非常昂贵的，对于有经济困难的患者来说此部分的费用占了移植总费用的重要比例。在早期的研究中，干细胞动员方案还未被应用，运用全部有核细胞计数作为移植物采集指标；有时会为单个病人采集相当于现在 20 倍数量的细胞用于移植，这不仅会增加标本保存成本，还会带来病人体液过量的临床问题。 CD34+ 细胞计数作为移植物采集量化标准解决以上所及的许多问题，但它也带来许多新的疑问。

 

米兰方案

第一个广泛应用的干细胞计数方案是由 Istituto Nazionale Tumori in Milan 的 Siena 等人创立的米兰方案（ Milan Protocol ）。在此方案中，需准备三管 50 ul 的血样或 leukapheresis 样本（如白细胞计数小于 150ul ，如受者样本，则样本和抗体均需加倍）；其中一管留出不作染色，一管加入 15ul 的抗 CD34 和 CD33 抗体，第三管则加入 15ul 的抗 CD2/CD19 抗体（计数 T 、 B 细胞）。细胞在 4 ℃ 下避光孵育 25 分钟，之后加入红细胞裂解液。孵育 15 分钟后加入不含钙、镁离子的 PBS 洗液 300g 离心 7 分钟洗涤，如果红细胞裂解不彻底则可重复裂解过程。弃上清后细胞可在 4 ℃ 保存并于一小时内上机检测。在光散射参数中分析所有细胞，建立门圈定所有白细胞（排除碎片），并设立一门去除有自发荧光的细胞。在调节完补偿后，分析 10000 个细胞， CD34+ 细胞可通过低 SSC 信号和 CD34 阳性表达加以区分。 CD34 弱阳性细胞一般不分析。

 

目前有很多米兰方案的改进版，分别从：运用不同的 CD34 抗体、不同的溶血技术、加入其他抗体来提高鉴别力、变换荧光标记、使用 CD45 抗体或其他核酸染料来更方便地鉴别白细胞等方面进行改进。运用这些技术后，报道的移植所需足够的并且能快速完成的 CD34+ 细胞数量有着巨大差异。经过仔细研究发现这些差异是由于在 CD34 细胞计数过程中运用了不同的标本处理、染色和分析方法造成的。因为在未动员的正常外周血中， CD34 阳性细胞通常小于全部有核细胞的 1% ，在经 G-CSF 动员后志愿者外周血中会大于 5% （有时在用血小板形成因子动员时可大于 20% ），对它们的精确计数对许多流式实验室是个重要的挑战。特别在计数小于 1% 时，又要做出检测来决何时进行采集时，精确计数显得格外重要。

 

Multi-Center 方法研究报告

Multi-Center 研究所在北美、欧洲、澳大利亚所做的一系列研究使得在精确计数中存在的储多问题逐步浮出水面。其中的一些问题最先在法国马赛招开的欧洲外周血干细胞计数研讨会中提出。在此次会议中，讨论了临床的 CD34 计数的价值与在各种检测方案中所应用的不同技术。并就外周血干细胞计数标准方案达成了一致。推荐方案中要求标本需预先作白细胞计数，用来染色的标本体积根据对 CD34+ 细胞数量估算来决定，分析时要求收集足够的有统计学意义的标本数量。方案中推荐使用双标记方法染色，其中包括将 2 ul 的 PE 标记的 CD3 抗体和 10ul 的 FITC 标记的 CD34 抗体（ QBEnd10 ）加入 250ul 的全血进行染色，室温下孵育 20 分钟，每 5 分钟用移液器吹打混匀一次；随后加入 Ortho 公司的红细胞裂解液孵育 9 分钟，每 3 分钟震动混匀一次；之后细胞在 300g 离心三分钟洗涤一次并用 PBS 重悬。使用改进的米兰方案进行检测，在光散射图中设门去除死细胞和碎片后分析 50000 个细胞。如果 CD34 阳性细胞计数小于 0.1% ，则需进一步分析，运用 FL2 设门去除 CD3+ 细胞群体和散射图中设门去除单核和粒细胞后再次分析。

马赛干细胞会议发展并拓展了一系列干细胞生物技术、干细胞计数和临床应用方面的欧洲协作组。其中最为重要的是， Sovalat 等人向 22 个实验室发送了新鲜的白细胞采集样本和相应检测单抗供染色与分析。由于使用了不同的检测技术得出了变异很大的计数结果，其变异率达 15-100% 。对染色方案中最具统一性的步骤是运用同型对照来去除非特异性染色。使用 FITC 标记的 CD34 抗体，克隆号为 8G 12 的其结果范围为 0.00-1.29% ， QBEND10 抗 CD34 的抗体为 0.17-17.8% 。其中一个中心运用 8G 12 测不出任何阳性颗粒，五个实验室报告 QBEND10 抗体测不出任何结果。运用 PE 标记的 CD34 抗体，结果的变异性要小得多，然而根据资料发现 8G 12 抗体检测的结果比 QBEND10 的结果变异率要高。只有一个实验室报告使用 QBEND10 无法得出检测结果。

英国流式细胞仪临床应用协会开展了更为广泛的研究，在此项研究中共分别向 15 个单位分两次派送了总共 28 份的白细胞采集品，其中 CD34+ 细胞的含量为 0.08-19.31% ，由此可得出检测结果在实验室内和外的变异率。每个样本实验室都按自己的计数方案进行检测，随后数据统一汇总。 CD34 阳性细胞的含量检测结果的最大 CV 为 100.1% ，绝对计数的 CV 为 136.6% 。

随后 Multi-Center 分析方法的应用系统地衡量了在 CD34 计数检测中的变化因素，其中包括：样本的运输、准备、染色、收集和分析。虽然其中涉及了很多因素很难分析，但依然发现许多关键问题所在。一项在北美 10 个研究单位中开展的实验中， Brecher 将 21 份已洗涤的骨髓或 PBPC 样本重复送至各研究所，并用其自己的方案染色和分析。其中三家单位应用统一的检测方案。 CD34 含量检测结果的变异数使用每个送检样本所得结果的最大值与最小值来表示：范围为 2.9 至 749 ，中位值为 76 。如去除其中两个实验单位报告的最高结果，变异范围缩小至 1.2 至 27 之间（中位值为 3.1 ）。在那些将方案标准化的实验室中，其变异范围为： 1.2 至 4.4 之间。在重复性方面，最小变异范围为 0 至 16.5 ，最大到 4.1 至 133 （这个单位只分析了 10000 个细胞）。在 CD34 绝计数中的变异范围则是“令人惊恐的”。如此巨大的变异是主要由于设门方案的不同引起的，并能通过使用标准化方案减小差异。澳大利亚的一个 Multi-Center 研究组证实这个结论，他们将 PBPC 标本派送至 20 家参与单位用其自己的方案进行检测。 CD34+ 细胞的比例范围为 0.64-2.80% ，中位数为 1.54% 。 20 家参与单位中，其中 9 家的结果在中位数的 10% 范围以内。将 List mode 文件给予 24 家参与单位并用其自己的方案分析，发现其差异主要由所用的分析方案不同造成的，有 17% 的单位检测结果超出中位数 10% 范围；当所有参与单位统一使用相同的分析方案则只有 0-7% 的单位超出 10% 的限制。最具统一性的方案是 ISHAGE 多参数分析方案，所有参与单位分析结果全部落于中位数的 10% 以内。

在一项由 Lumley 组织的研究中，他将冷冻保存的白细胞采集品在冷藏条件派送至 8-12 家参与单位分析其中 CD34 阳性细胞的百分比含量。研究的第一步是将 12 份标本送至 8 家参与单位，每家单位使用其自己的染色、分析方案（基于米兰方案）进行检测并获得结果。对所有结果汇总统计发现其 CV 值为 50-235% ，在统计学上有显著差异，其中一家单位的结果显著地与其他单位检测结果差异的 5% 水平。第二步研究是将另外 12 份样本送往 12 家参与单位，每家单位使用克隆号为 HPCA-2 ， PE 标记的 CD34 抗体，并用 FITC 标记的 CD45 识别白细胞，收集 50000 个细胞，但实际中有 27% 的单位没有收集如此多的样本进行分析。对全部结果汇总分析后，其 CV 值为 23-127% ，虽仍具有统计学差异，但没有哪家单位的结果与其他单位结果的差异在 5% 水平。此时，去除那些� 2SD 平均值的结果，发现这些值都出于同一实验室。经汇总统计发现，使用标准方案得出的结果降低了结果的 CV 值：由第一阶段的平均 CV 值 137% 降至第二阶段的平均 CV 值 69% 。但这也可能是因为第二次计数获得的检测结果比第一次高（第二阶段 1.92% VS 第一阶段 1.23% ）造成的。此研究表明各个实验室之间 CD34 计数结果的 CV 值仍过高以致于无法比较各个实验室所检测值。

其他研究组也对影响计数结果的因素进行了广泛的检查，如通过提供统一试剂或发行标准分析方案来进行。尽管这些研究减少了一些检测差异，但要进一步地提高实验的精确性需对各个检测中心进行全面的培训并发展标准的计数方案。此项工作由 Nordic Myeloma 研究组广泛开展，他们组织了两个协作组来制定计数标准方案并在 24 个实验室中进行来提高 CD34 计数的准确性。第一次协作工作主要集中于标准化标本处理方法；其间制定了一样本处理的标准方法：要求样本在 4 小内分析；使用 Ortho 溶血剂与标本孵育 8 至 10 分钟溶血； 5-10 x 105 细胞与克隆号为 HPCA 的 PE 标记的 CD34 抗体室温下孵育 15 分钟，同型对照同等条件处理；洗涤 2-3 次后用 150ul 1% 的多聚甲醛固定。用米兰方案识别低 SSC 信号的 CD34 阳性细胞，共分析 50000 个完整细胞，并减去同型对照阳性颗粒的数量。

在第二次协作中， Nordic 首先向参与单位分发了含有三个病例 List mode 数据的磁盘供分析。发现在参与单位之间的分析结果差异很小（如对于含有 0.29% 和 1.36% 的两个样的标准差分别为 0.04 和 0.17 ）。随后参与单位又收到了先染色后固定的和还未染色的两种样本。随后对 24 家参与单位的 22 家结果分析表明结果比较一致（ r>0.9 ），尽管其中有实验室一直报告较高或较低值。在三阶段中，参与单位要求使用第一次协作中制定的标准方案来检测送检样本。结果显示 CD34 计数的平均值为 0.68% ，标准差为 0.08 。使用更为统一的方案来检测下一标本时，其平均值为 3.0%+0.26 ，范围是 2.6-3.3% 。最终的推荐方案是：溶血步骤可在染色前或染后进行；加与不加鼠 IgG 来封闭非特异染色不影响结果；如果检测中发现有非特异性染色，则需阻断后再进行检测；无需对样本进行过滤；孵育与分析之间样本最好只洗涤一次。为了绝对计数 CD34 细胞，需对样本进行 10 倍稀释后进行白血胞计数。

应用标准化方案来计数 CD34 细胞在 Benelux 的研究中进一步被证实。实验室之间在未用标准方案前的检测变异系数 34-106% 在应用标准方案后下降至 18-30% 。错误应用方案后，变异系数又增加至 50-82% 。

这些研究表明，在 CD34 计数检测中有众多因素影响着计数的准确性。这些因素可通过以下操作步骤来去除这些影响： 1 ，尽量减少对样本处理步骤； 2 ，使用适当标记的抗体； 3 ，选择适当的阴性和阳性标本； 4 ，收集足够的细胞数来降低变异系数； 5 ，采用标准设门和分析方案。但以上任何一条现都没国际上通用的标准，很清楚我们需要为 CD34 干细胞计数设立一广泛同意的标准来减少其中的变异性。现将一些标准总结如下。

 

样本准备

现有很多种方法运用于干细胞计数的样本准备及分析中。在早期研究中，细胞经常经 Ficoll 淋巴细胞提取液来富集单个核细胞，然后反推外周血或采集品的细胞比例。这种计算方法经常会得出不精确的评估数据，但能部分地反映标本中的细胞量。 Fritsch 报道单个核细胞分离操作会导致外周血中 26% 的、骨髓中 21% 的、采集品中 5% 的 CD34+ 细胞丢失。现在基本弃用单个核细胞富集法，而改用对全血进行溶血来去除红细胞。在这个操作步骤中，在未经处理的标本中直接加入荧光标记的 CD34 抗体进行染色，通过加入溶血剂溶解红细胞的步骤可在染色前或染色后进行。这样使经血球仪计数的白细胞数与流式细胞仪经 CD45 设门后计数的白细胞数更容易比较。一个对不同样本处理技术的系统比较发现洗涤步骤会导致部分白细胞群体丢失，从而造成 CD34+ 细胞的过量计数。这种过量计数可通过在溶血后计数白细胞作为分母计算而非在溶血前来纠正。溶血后不洗方法可保存样本中各种白细胞群体，但这样会改变细胞的光散射信号并增加荧光的非特异染色本底。这样就会导致底估 CD34+ 细胞绝对计数。尽管每种标本处理方法都有其不足之处，但本研究推存使用：先裂解红细胞；洗涤样本；进行白细胞计数作为计算分母；最后进行染色步骤。在本研究中，笔者使用不含固定剂的氯化铵溶血剂（ Ortho 公司）室温下溶血 5-10 分钟，随后洗涤 2 次后染色。对于先染色后溶血的样本，要求白细胞数在 2000-3000/ul ，这样可避免因样本量过大而造成染色和分析时间加长；样本在此法处理后无法再进行白细胞计数。相比而言，溶血 / 洗涤法可预先获知样本的白细胞数并能够分析原样中白细胞含量小于 50 /ul 的样本。

 

溶血剂

通过对不同溶血剂（ FACS Lysing solution Bection Dickinson; Immunolyse Beckman-Coulter; Optilyse B Immunotech, ImmunoPrep Beckman-Coulter ； OrthoMune Ortho; ACK BioWhittaket ）的比较发现它们的效果各不相同。各染血剂溶血后 CD45 阴性碎片占总颗粒数百分比为： ACK ， Immunolyse: 80% ；其他溶血剂大约为 50% 。 Optilyse 和 FACS 溶血后淋巴细胞比例最低，当使用 ACK 和 OrthoMune 后 CD4 和 CD8 阳性细胞比例不稳定，但所有的这些溶血剂都能使 CD34 阳性细胞明显地与阴性群体相区分。对于溶血及固定型试剂的检测也得出了相似的结论。这些观察结果显示溶血剂并不象我们所认为的对 CD34+ 细胞计数无影响。要避免延长溶血时间，除非标本已置于冰上停止了溶血。

 

样本问题

有些样本可能存在某些特殊问题。血小板可能会与 CD34+ 或 CD34- 细胞结合影响精确计数。这个问题可通过增加 EDTA 来解决。聚集的血小板可能会与 CD34 、 CD45 抗体微弱结合，但可通过巧妙的设门方案将其去除。

 

样本的储存及运送

越来越多的采集品因要合并或体外富集或要被运送至流式检测中心，样本都需被过夜保存。在以上这种情况下，样本中细胞群的活性和被分析细胞潜在的改变等问题逐步显现出来。现在对这些细胞最佳的存储及运输条件现在还未明确地建立。各个实验室对标本保存温度从室温至 4 ℃ 不等；加或不加营养剂都有。不同的标本盛放容器和一些与血小板集聚有关的因素现已被严格限定。 Gutensohn 报道采集品在室温下保存 24 小时后，用 HPCA-2 和 QBEND10 两种克隆号的单抗检测发现 CD34+ 细胞分别下降了 25.4% 和 27.0% 。样本在运输过程中的晃动会增加大概 10% 的抗体非特异性染色，主要是由髓系细胞和死细胞造成的。相对而言，如标本储存在 4 ℃ 条件下， CD34+ 细胞不会有明显下降。尽管现在低温运送标本已变得可行，但一些冷冻剂会影响细胞表面抗原的表达。 Rosillo 等人报道当髓细胞暴露在 DMSO 中时会使细胞下调表达 CD7 ， CD13 ， CD33 和 CD34 并且也影响一些其他一些抗原表达强度。但 Farley 却得出了不同的结论，他发现冷冻剂即不影响细胞的光散射属性也不影响细胞标本中 CD34+ 细胞的比例。现在由于样本被广泛运送检测加之缺乏适当的标本储存和运输知识，又一些抗体会与死细胞起非特异结合，要求对样本进行活性检测来去除细胞中的死细胞。可用的试剂有 PI 、 7-AAD 或 LDS-751 。

 

CD34 抗体的选择

对于 CD34 抗体及其荧光素的选择现还有争论。最初因缺乏直标的 CD34 抗体，采用未标记的 CD34 抗体与 FITC 标记的荧光二抗来间接检测。这样一来使原本复杂的检测与二抗的非特异结合和如何识别阳性细胞等问题掺杂在一起，更难以处理。随后一系列不同荧光素标记的 CD34 抗体的出现使以上情况有所改观。这些抗体能与 CD34 抗原的 I 、 II 、 III 类位点结合， CD34 的不同抗原位点可根据其对不同的蛋白水解酶的敏感性来区分。对 Vibrio cholera 神经氨酸苷酶和 Pasturella hemolytica 起源的糖蛋白酶敏感的称之为 I 类位点，针对此位点的抗体克隆号有： MY10 ， B1.3C 5 ， 12.8 和 ICH3 。对唾液酸不敏感但能与 PhG 粘附的称之为 II 类位点，识别此位点的抗体是 QBEND10 。对以上几种酶都耐受的，称之为 III 类位点，可被 8G 12 、 TUK3 、 115.2 等克隆号的抗体可识别。

使用 III 类位点特异性抗体能最大限度地提高检测的敏感度。这是因为抗体与荧光素结合后，其结构可能会发生改变从而导致一些抗体无法完全检测某些样本中的 CD34+ 细胞。基于以上情况，发现针对 I 类抗原的抗体此问题最为严重，它在与荧光素结合后，如 FITC ，即失去活性；此外还发现这些抗体与 PE 荧光素结合后其特异会严重下降。相对而言， PE 标记的 II 类抗原能够检测样本的所有 CD34+ 细胞，但它一旦与 FITC 结合后也会丧失一部分结合能力。使用抗 II ， III 类位点的抗体计数采集品与脐带血中 CD34+ 细胞，发现其相关性系数为 0.975 。现普遍推广使用与 III 类位点结合的抗体，这些抗体能有效地与多种荧光素结合如： FITC 、 PE 、 PerCP 、 APC 和 PE-CY5 。任何标记的抗体都要仔细观察其是否会有潜在的交叉反应，此外还要注意它们可能会与某些样本中聚集的血小板结合。

对于 II 类位点的抗体在计数骨髓或外周血中 CD34+ 细胞时，其有效性评价不一。有报道认为 QBEND10 抗体因其与死细胞的结合而增加非特异性染色且与目标细胞的结合强度也不高，所以它不适合作干细胞计数。但 FITC 标记的抗体确实存在以上情况， FITC 标记的抗体阴性检测结果就能说明这种情况，而 PE 标记的抗体则正常。

 

阴性对照

干细胞计数中另一个难点是如何选择一个恰当的阴性对照。一般在流式细胞仪上，选用与抗体标记相同的同型免疫球蛋白作为非特异性染色的本底，但这种方法没有体现针对具体抗原的非特异性染色的情况。在用 CD34 抗体染色的标本中，目标细胞群可能少于总细胞群的 0.1% ；而只有目标细胞群大于 1% 时才合适用同型作为阴性对照，这样就很难区分检测管中的阳性细胞是特异性染色或非特异性的。

另一种可选方案是采用多参数设门技术来区分特异性结合群体。通常 CD34 阳性细胞同时也表达 CD45 ，并且这些细胞的光散射信号也有其特征。在 CD45/SSC 双参数图中， CD34 阳细胞与淋巴、单核、粒细胞相分离独立成群。平行对比实验发现用多参数设门检测的阳性细胞中不含有荧光标记的同型对照阳性的细胞。实验表明多参数检测或结合逻辑设门将成为一标准，特别是在运用定量技术检测特殊的染色细胞群体时。这个方案要检测样本中的极少数细胞群时显得格外重要。

有学者建立了另一阴性对照方案，他将已与未标记的 CD34 抗体孵育后的标本再与荧光标记的 CD34 抗体孵育，此时阳性的细胞则算为非特异性染色。但考虑到未标记的 CD34 抗体也存在非特异性染色，可能会覆盖标记抗体的非特异性染色。此法还未与同型对照作过比较。

 

阳性对照

在临床检测中需要检测阳性样本，据此来检查操作过程是否正确，并可作为质控。在 CD34 检测项目中，要取得易制备、稳定可靠的阳性标本并非易事。现有几种制作方案被实验室接受。阳性标本一般使用各种表达 CD34 抗原的细胞株来制备。运用最广的是 KG1 这强阳性表达 CD34 的细胞株，当它被加入至临床样本中时，不会影响原样本中的各细胞染色属性（ Coulter 和 R&D 公司的质控试剂使用的就是这种技术）。由于这些细胞形态较大有其特有的光散射属性，它们作为 CD34+ 细胞加入未动员的全血中并不能很好的模拟真实的样本，从而使检测质控样本的方案不能适用临床样本。虽然有可能从一个长期志愿者身上抽取样本作为质控，但由于无法得知其真正的阳性细胞数，又该法很难常规单位实行所以并不理想。以上问题可通过收集同一个具有高和低 CD34+ 细胞数病人的标本，将其分装后冻存。冻存后的样本在光散射信号与 CD34 表达上与新鲜样本比较一致。每天可检测一管解冻扣的样本作为阳性质控品。当使用这些样本作质控时，要检测样本中细胞活性并要使用多参数方案来减小差异。

在美国，临床实验室中的操作技能考核也要同时进行，这些考核标准由若干家研究机构的临床流式实验室共同制定，其包括 College of American Pathologists 和 PTP 。这些测试是在正常样本或白血病样本上进行的，而不使用 CD34+ 的血细胞样本。这是由于各个实验室对 CD34+ 细胞计数报告的给果差异实在太大，又不能找到大批量、稳定的、已了解清楚的样本来进行考核。如能够制备出抗原染色稳定、适用面广、储存方便、使用效期长的质控品，则以上问题可得到解决。如以上任务能达成将能加速发展能减少实验室间与实验室中变异的实验技术。今后或许可使用流式标准微球来达成此目的。

 

样本获取

另一个值得注意的问题是在干细胞计数中要分析多少个细胞。传统实验中，如分析目标在白细胞群体中，一般采集 5000 至 10000 个细胞分析。但当进行 CD34 干细胞计数时，由于 CD34+ 细胞一般只占 1% 整单个核细胞，固可将其视作泊松分布曲线，如要得到一个变异系数为 10% 左右值，就要采集 100 个阳性细胞；采集的细胞数量要根据 CD34 细胞的比例来决定。尽管理想状态下，应对每个样本采集尽可能的细胞进行分析，但鉴于标本细胞的数量、流式所有软件的功能、和数据的存储空间等因素的限制而无法做到。普通实验室一般在未设门的光散射图中收集 50000 至 75000 个细胞进行分析，来获得一个比较精确的结果。在分析过程可通过设门排除死细胞，但一旦去除这些细胞会使其后所分析的细胞群体数量减少。

 

数据分析

如上分析所见，要检测阳性细胞需要进行双参数或多参数分析。后者多参数分析有助于排除样本中 CD34 弱表达群体，其可能包含细胞碎片或其他非干细胞颗粒。许多实验室还加检了 CD38 、 CD33 和 CD90 来进行一步计数更为原始的干细胞，或来寻找与临床移植效果更有相关性的细胞群体。这种分析要求流式操作者具有更多的操作和统计技巧。现有很多分析方案可用于此目的；其中一些是基于原来米兰方案修改而来，它是通过 CD34/SSC 设门去除细胞碎片、红细胞和聚集物；阳性颗粒需要满足： CD34 阳性表达， SSC 信号较弱，细胞独立成群。有学者使用 7-AAD 染色去除死细胞，用 CD14 去除单核细胞的方法来分析。首先设门选取 7-AAD 阴性的细胞，并将其显示在 CD34/CD14 双参数图中并从中去除单核细胞；在此方案中，可将 CD34 阳性细胞再次显视在 CD34/SSC 图中分析并与相应的同型对照作比较。随后对于以上方案又有修改，将 CD45 替代 7-AAD 设立白细胞门，后进行分析。

 

 

ISHAGE 方案

Sutherland 于 1994 年在它的研究使用与以方案相似的手段分析，随后此方案被 ISHAGE 收录作为推荐方案使用，旨在确立一个普遍通用的、可排除实验室中或实验室间差异的方案。这个方法是由门不断累加来完成的。第一个门是基于 CD45/SSC 双参数图上的；通过对其设门可去除红细胞、碎片、和聚集物，这些干扰在造血细胞样本中尤为多见，特别是在样本使用溶血 - 免洗法处理后。通过此步骤也为以后计算 CD34 阳性细胞比例提供了可靠的分母（总白细胞数量）。在 R1 门中，最少要包括 75000 个细胞，并在 R4 门要计数超过 100 个 CD34 阳性细胞。将通过 R1 门获取的细胞显示在 CD34/SSC 双参数点图，在此图中设立 R2 门并调节其位置包含所有 CD34 强阳性或弱阳性的并 SSC 信号弱及中等的细胞。建立一 CD45/SSC 双参数点图，将以上 CD34 阳性细胞显示于其中；在其中设门 R3 门去除 CD34 阳性颗粒中的聚集血小板、淋巴细胞和单核细胞。将 R3 门中圈定的细胞显示在 FS/SS 图中以检测细胞是否落在平时的幼稚淋巴细胞门 R4 中，通过 R4 要去除比淋巴细胞小的颗粒。（注：如何确定 R4 门的位置呢？方法如下：在 CD45/SSC 双参数点图中设立 R5 门圈定 CD45 强阳性且 SSC 低信号的淋巴细胞群体，将 R5 门中的细胞显示在 R4 门所在的 FS/SS 双参数直方图中，根据其中的淋巴细胞的位置调节 R4 门，确定 R4 门在 FS 和 SS 轴上最小值的最低范围。）在脐血标本中，会出现 CD45/CD34 双阳性的血小板集聚颗粒，但它们的侧向散射光弱于真正的 CD34 阳性细胞，可被处于幼稚淋巴细胞位置的 R4 门排除。最终在 R4 门中读取 CD34 阳性干细胞计数的数值。此时如检测 CD45/ISOTYPE 双染的阴性对照，在 ISHAGE 方案设门分析，在 R4 门中几乎不见非特异性染色的颗粒存在。如在某些情况下 R4 出现非特异性染色颗粒，则在样本计数时要从 R4 门减去非特异性染色的细胞数。

 

 

对于此方案有一争论，是否所有 CD34 特异性染色的颗粒 CD45 都是弱表达。这了解决此疑问，在仪器调节和设门方面又作了改进，两个独立的直方图被加入上述的四图型方案中。在第个直方图中增设 R5 门来精确圈定淋巴细胞： CD45 强阳性且 SSC 低信号。并将这些细胞显示在第 6 个 FS/SS 双参数直方图中。据此可确定 R4 门的圈定幼稚淋巴细胞最小范围（第 4 个直方图为第 6 张的拷贝）。这样就能最大限度地去除血小板、未裂解的红细胞、和其他碎片。这张直方图还可以确定 FS 的预值设置是否适当， FS 和 SS 的电压设置是否足够。因为在此图中要确保 CD45 阳性的最小淋巴细胞能够适当地在 FS/SS 图中显示出来。建议最小淋巴细胞的 FS 参数强度在 1024 线性坐标上，位于 200 左右的位置上。当 FS/SS 的电压及域值都设置完毕后，调整第 1 直方图中 R1 门的位置，使其包括所 CD45 弱阳性和阳性颗粒。 R1 门在 CD45 从标的下限则根据以下直方图来确认：建立第 5 张 CD45/CD34 双参数直方图，根据 CD34 阳性颗粒的 CD45 表达的最小值建立十字门，确保所有 CD34 阳性 CD45 极弱表达的细胞全部在 CD45 设定界线的左侧；然后根据此进的 CD45 界线位置确定 R1 门的最小值。

 

CD34+ 细胞百分比检测可通过对白细胞决对计数转换成 CD34+ 细胞决对计数。在原有的 ISHAGE 方案基础上，在第三或第四荧光通道中检测已知数量的标准微球便能达成以上目的。这样就能使无法定量的单平台流式细胞仪变为能直接绝对计数干细胞的精确仪器。 ISHAGE 方案完全兼容使用 7-AAD 荧光染料进行样体活性检测，这样就能在样本中绝对定量计数有活性的 CD34+ 阳性细胞。这一点对临床上在检测抽取或合并时间过长的样本时十分有意义。

DNA/RNA 染料 /CD34PE/CD45PC5+ 定量荧光微球（ PerfectCountR kit for CD34+ Cell Enumeration , Multi Sciences Co.Ltd ）检测试剂盒分析说明

DNA/RNA 染料在 FL1 中检测，用来识别所有有核细胞，在流式细胞仪分析时作为圈定白细胞的基础。

采用标准 ISHAGE 方法进行 CD34PE/CD45PC5 染色分析，绝对定量微球 BD 机器在 FL4 通道内检测， Coulter 机器可在 FL3 通道内检测。