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细胞计数实验(细胞计数实验)

别名:细胞密度,细胞如何计数

最新修订时间:

原理

细胞悬液制备后,需要计算悬液中所含细胞数量;一般以细胞数/mL 表示。因只有健康的细胞才有活力,接种后能够生长增殖,所以在接种关应先检查一下细胞的活力。

材料与仪器

器材:培养液吸管

试剂:细胞悬液、台盼蓝、酒精。

步骤

(1) 计数板

用 96% 酒精冲洗计数板后,用干净鹿皮擦净,另擦净盖片一张;把盖片覆在计数板上面,使之微微移向一侧,露出计数板台面少许,以便滴加细胞悬液。

(2) 染色

取吸管 1 支,伸入培养瓶中,轻轻反复吹打细胞悬液使细胞重悬均匀后,立即吸细胞悬液少许,向另一离心管中滴入细胞悬液 9 滴,再滴入台盼蓝染液 1 滴,混匀,置 2~3 分钟。

(3) 加悬液

把计数板平放在显微镜台上,立即从计数板边缘轻轻滴 1~2 滴已染色的细胞悬液,使之充满计数板和盖片间空隙中。

(4) 镜检

镜下观察可见细胞分散各处,健康细胞胞体完整,透明不着色,凡着色细胞均为不健康者。计算四角大方格内的细胞数;压中线者只计算左线和上线者,右线和下线不计算在内(即仅计算压两个边的细胞)。

(5) 接种

培养通过计数测知悬液中细胞数后,可根据实验所需细胞数量向培养容器中接种。细胞接种数量随实验目的、血清含量和细胞生物性状而定;一般接种量在 1~10 × 105 细胞/mL 范围,实验周期短,希望细胞增殖较快时,接种量可大些。用含血清量大的培养液培养胚胎来源细胞、无限细胞系和恶性细胞系时,细胞接种数量不宜太大。

注意事项

(1) 向计算板中滴细胞悬液时要干净利落,勿令液面盖过盖片,加量要适当,过多易使盖片漂移,过少易出现气泡,不理想时应重做。

(2) 镜下计数时,偶见有由两个以上组成的细胞团,应按单个细胞数计算,如细胞团数占 10% 以上,说明消化不充分;功细胞数少于 200 个 / 10 mm2 或多于 500 个 / 10 mm2 时,均说明稀释不当,需重新制备细胞悬液,再重计数。

(3) 经常使用同一细胞在相同条件下工作时,对各种情况已做到心中有数情况下,可略去某些环节,如染色检查等;计算板计算细胞数法有一定误差,用作测定细胞生长曲线时,每一样品应重复计算 4 次,取均值,较为可靠,若有电子细胞计数仪器当然更好。

(4) 体外培养细胞在悬液中呈圆形,平均直径 8~10 μm,当被接种到底物上生长时,经过延展后,则呈扁形,在底物上所占的面积按直径算可达 20~25 μm,则 1 cm2 的底物上可容纳 4~5 万个这样的细胞,这是理论上的数值,但在实际应用中,当细胞达到 80 % 汇合状态时便应做传代处理,因此细胞数量比上述理论数量少。

来源:丁香实验

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