植物钙调磷酸酶(CaN)酶联免疫分析(ELISA)
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植物 钙调磷酸酶(CaN ) 酶联免疫 分析( ELISA )
试剂 盒使用说明书
本试剂仅供研究使用 目的:本试剂盒用于测定植物组织,细胞及其它相关样本中 钙调磷酸酶(CaN) 含量。
实验原理 :
本试剂盒应用双抗体夹心法测定 标本 中 植物 钙调磷酸酶(CaN ) 水平。用纯化的 植物 钙调磷酸酶(CaN ) 抗体包被微孔板,制成固相抗体,往包被单抗的微孔中依次加入 钙调磷酸酶(CaN ) 抗原 ,再与HRP 标记的 钙调磷酸酶(CaN ) 抗体结合,形成抗体- 抗原 - 酶标抗体复合物 ,经过彻底洗涤后 加 底物TMB 显色。 TMB 在 HRP 酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的 钙调磷酸酶(CaN ) 呈正相关。用酶标仪在 450 nm波长下测定吸光度( OD 值), 通过标准曲线 计算样品 中 植物 钙调磷酸酶(CaN ) 抗原 浓度。
试剂盒组成 :
试剂盒组成 |
48孔配置 |
96孔配置 |
保存 |
说明书 |
1份 |
1份 |
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封板膜 |
2片( 48 ) |
2片( 96 ) |
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密封袋 |
1个 |
1个 |
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酶标包被板 |
1 ×48 |
1 ×96 |
2-8℃保存 |
标准品:27 U/L |
0.5ml× 1 瓶 |
0.5ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
标准品稀释液 |
1.5ml× 1 瓶 |
1.5ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
酶标试剂 |
3 ml× 1 瓶 |
6 ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
样品稀释液 |
3 ml× 1 瓶 |
6 ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
显色剂A 液 |
3 ml× 1 瓶 |
6 ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
显色剂B 液 |
3 ml× 1 瓶 |
6 ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
终止液 |
3ml× 1 瓶 |
6ml× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
浓缩洗涤液 |
(20ml × 20 倍)× 1 瓶 |
(20ml × 30 倍)× 1 瓶 |
2-8℃保存 |
标本要求:
1.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验,可 将标本放于 -20 ℃保存,但 应 避免反复冻融
2.不能检测含NaN3的样品 ,因NaN3 抑制辣根过氧化物酶的( HRP )活性。
操作步骤:
1. 标准品的稀释与加样:在酶标包被板上设标准品孔10 孔,在第一、第二孔中分别加标准品 100 μ l,然后在第一、第二孔中加标准品稀释液 50 μ l,混匀;然后从第一孔、第二孔中各取 100 μ l分别加到第三孔和第四孔,再在第三、第四孔分别加标准品稀释液 50 μ l,混匀;然后在第三孔和第四孔中先各取 50 μ l弃掉,再各取 50 μ l分别加到第五、第六孔中,再在第五、第六孔中分别加标准品稀释液 50ul ,混匀;混匀后从第五、第六孔中各取 50 μ l分别加到第七、第八孔中,再在第七、第八孔中分别加标准品稀释液 50 μ l,混匀后从第七、第八孔中分别取 50 μ l加到第九、第十孔中,再在第九第十孔分别加标准品稀释液 50 μ l,混匀后从第九第十孔中各取 50 μ l弃掉。(稀释后各孔加样量都为 50 μ l,浓度分别为 18 U/L ,12 U/L ,6 U/L ,3 U/L ,1.5 U/L)。
2. 加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂,其余各步操作相同)、 待测样品孔 。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40 μ l,然后再加待测样品 10 μ l(样品最终稀释度为 5 倍)。 加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁, 轻轻 晃动 混匀 。
3. 温育:用封板膜封板后置37 ℃温育3 0 分钟 。
4. 配液:将30 ( 48T 的 20 倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 ( 48T 的 20 倍)倍稀释后备用。
5. 洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体, 甩干 ,每孔加满洗涤液,静置30 秒后弃去,如此重复 5 次,拍干。
6. 加酶:每孔加入酶标试剂50 μ l,空白孔除外 。
7. 温育:操作同3 。
8. 洗涤:操作同5 。
9. 显色:每孔先加入显色剂A50 μ l,再加入显色剂 B50 μ l,轻轻震荡混匀, 37 ℃避光显色15分钟.
10. 终止:每孔加终止 液50μl ,终止反应 (此时蓝色立转黄色) 。
11. 测定:以空白空调零, 4 50 nm波长依序测量各孔的 吸光 度(OD 值) 。 测定应在加终止液后15 分钟以内进行。
注意事项:
1. 试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30 分钟后方可使用,酶标包被板开封后如未用完,板条应装入密封袋中保存。
2. 浓洗涤液 可能 会有 结晶 析出,稀释时可在水浴中加温助溶 ,洗涤时不影响结果。
3. 各步加样均应使用加样器,并经常校对其准确性,以避免试验误差。一次加样时间最好控制在5 分钟内,如标本数量多,推荐使用排枪加样。
4. 请每次测定的同时做标准曲线,最好做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD 值大于标准品孔第一孔的 OD 值),请先用样品稀释液稀释一定倍数( n 倍)后再测定,计算时请最后 乘以 总稀释倍数( ×n×5 )。
5. 封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。
6. 底物请避光保存。
7. 严格按照说明书的操作进行,试验结果判定必须以酶标仪读数为准.
8. 所有样品,洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。
9. 本试剂不同批号组分不得混用。
10. 如与英文说明书有异,以英文说明书为准。
计算 :
以标准物的浓度为横坐标,OD 值为纵坐标,
在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD
值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以 稀释
倍数 ;或用标准物的浓度与OD 值计算出标
准曲线的直线回归方程式,将样品的OD 值
代入方程式,计算出样品浓度,再乘以 稀释
倍数 ,即为样品的实际浓度。
(此图仅供参考)
试剂盒性能:
1.样品线性回归与预期浓度相关系数 R 值为 0.95 以上。
2.批内与批见应分别小于 9% 和 11%
保存条件及有效期:
1.试剂盒保存: ;2-8 ℃ 。
2.有效期: 6 个月
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