酵母细胞的培养与观察操作指南

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一、实验目的

1.掌握酵母细胞的培养 方法

2.学会使用相差和微分干涉显微镜

二、异源互补技术概述

酿酒(芽殖)酵母的培养在许多方面可以与大肠杆菌相比较。这种酵母可以用标准的微生物学技术在液体和固体培养基中进行培养。大多数酵母菌 株在复合液体培养基中的倍增时间为90～120min，到静止期时细胞滴度为3×108到5×108细胞/mL。单个细胞在复合固体培养基上经过36 hr可长成1～2mm的单菌落，在合成的有限培养基中生长较慢，倍增时间至少增加为原来的两倍，且细胞的最终滴度仅达到2×107到3×107细胞/mL。在有限培养基平板上菌落需大约60 hr才能长成容易计数的大小。在复合或有限培养基上生长的菌落能影印培养或转移到膜上，进行分子水平的分析。

非洲粟酒裂殖酵母和其近亲酿酒酵母一样，是一种子囊真菌，但它与发芽酵母的关系并不密切，两种酵母的蛋白质序列和基因同源性在60﹪到90﹪。与酿酒酵母相比，非洲粟酒裂殖酵母通常是单倍体细胞，可分为两种交配型，在饥饿情况下不同的交配型单倍体进行交配，形成杂合的双倍体合子。双倍体合子经过减数分裂形成4个孢子，由孢子发芽而长成单倍体菌落。非洲粟酒裂殖酵母具有典型的真核生物的细胞周期，包括G1、S、G2和M 四个时期。在基本或复合培养基中其世代时间为2到4个h，其中G2期占细胞周期的70﹪，其它期各占10﹪。

三、材料、试剂和仪器

1. 材料

酿酒芽殖酵母(Saccharomyces cerevisiae)和非洲粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces kephir)。

2. 试剂

1)酿酒芽殖酵母的培养基

(1)YPD(YPED)液体培养基(用于酵母菌摇培，100mL)

细菌培养用蛋白胨(Bacto-peptone) 2g

细菌培养用酵母提取物 (Bacto-Yeast extract) 1g

葡萄糖(Glucose，配成40%detrose贮液单独灭菌,4℃保存) 2g

加ddH2O至90mL，调pH值至4-5，定容至95mL，高温灭菌(121℃,15min)。待温度降至55℃时，加入5mL预热(至少室温放置30min)无菌的40%detrose贮液。

(2)YPD(YPED)固体培养基(可用于保菌或培养，100mL)

在YPD液体培养基的营养物中加入2g琼脂粉，加ddH2O至90mL，调pH值至5.8，定容至95mL，高温灭菌(121℃, 15min)。待温度降至55℃时，加入5mL预热(至少室温放置30min)无菌的40% detrose贮液。

(3)YPAD(斜面)培养基(可用于保菌或培养营养缺陷菌株，100mL)

在YPD液体培养基中加入硫酸腺嘌呤(Adenine hemisulfate salt，腺嘌呤半硫酸盐)40mg，琼脂(Bacto-agar)(液体培养基不加)2g。加ddH2O至90mL，调pH值至5.8(液体调至4左右)，定容至95mL，高温灭菌(121℃,15min)。待温度降至55℃时，加入5mL预热(至少室温放置30min)无菌的40%detrose贮液。分装培养基，倾斜放置形成斜面，每支试管依大小可加入3-5mL培养基。(若葡萄糖直接加入培养基则可先分装至试管后灭菌(需要棉塞)，灭菌会造成葡萄糖碳化，培养基略变褐色，对酵母培养会略有影响)。该培养基用于4-6个月的短暂保菌或酵母培养。

2)非洲粟酒裂殖酵母的培养基

(1)YE培养基(100mL)

酵母提取物 0.5g

葡萄糖(Glucose，配成40%detrose贮液单独灭菌，4℃保存) 2g

细菌培养用琼脂(Bacto-agar) 2g

加ddH2O至90mL，调pH值至5-6，定容至95mL，高温灭菌(121℃,15min)。待温度降至55℃时，加入5mL预热(至少室温放置30min)无菌的40%detrose贮液。

(2) YEA培养基(100mL)

YEA配方中含有150mg/L的腺嘌呤。用于培养尿嘧啶缺陷株的培养基，应加入150mg/L的尿嘧啶以利于最佳生长。

3. 仪器

恒温培养箱，恒温摇床，相差/微分干涉显微镜，普通光学显微镜

四、实验程序

1.酵母菌的摇培 无菌条件下，用接种环或微量取样器将酵母菌菌种接种于YPD液体培养基和非洲粟酒裂殖酵母的培养基，28-30℃,200rpm恒温摇床摇培过夜。

2.制片、压片，明视野显微观察。

3.相差显微镜的使用与标本观察。

4.液体培养基中细胞滴度的检测

5.分光光度测定法

1)YPAD过夜培养物用水稀释100倍。

2)用分光光度计测定600nm处的光密度。

3)记住稀释倍数，计算原始培养物的细胞数。

例如：在YPAD中100倍稀释的培养物的OD600为0.21，可按下式计算：

0.21(OD600)×100(稀释倍数)×1×106(个细胞/mL)/0.1(OD600)=2.1×108个细胞/mL

对于OD600和细胞滴度之间的对应关系应分别测定，可通过将特定OD600的培养物稀释后涂板检测每毫升的活细胞数。

6.血细胞计数器计数法

1)YPAD过夜培养物用水稀释10倍。

2)将细胞悬液小心地加在盖片和血细胞计数器之间。10×物镜和10×目镜观察，相差显微镜观察效果更好。让细胞在血细胞计数器的网格中停留几分钟。网格区为1mm2，分成25个相同大小的方格，其容积为10-4mL。

3)计数5个对角方格中的细胞数量，乘以5即是整个网格区细胞的总数。

4)计算细胞滴度：计数的细胞数×5×稀释倍数×1/血细胞计数器25个方格的容积。

例如：5个对角方格中计数的细胞为239个，其滴度计算应是：

239个细胞×5×10(稀释倍数)×1/10-4mL=1.2×108个细胞/mL