引物的稀释和使用
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2. 引物 序列的分子量计算公式如下:
MW=(A碱基数×312)+(C碱基数×288)+(G碱基数×328)+(T碱基数×303)-61
例如:引物TGGGCGGCGGTTGGTGTTACG A=1 C=3 G=11 T=6
MW=(1×312)+(3×328)+(6×303)-61=6541
3. oligo DNA的分子量也可以用以下近似方法计算:Oligo DNA中的每个脱氧核苷酸碱基的平均分子量近似为324.5,则一条Oligo DNA的分子量=碱基数×324.5。
例:您得到一管标为5 OD260的20 mer Oligo DNA
分子量=20×324.5=6490
质量数=5×33=165μg
摩尔数=165/6490=0.025μmol=25nmol
若加灭菌双蒸水400μl溶解,则浓度为25nmol/400μl=62.5μM
4. 装有引物的eppendorf管一般保存于-20℃,临用前稀释。
5. 由于Oligo DNA呈很轻的干膜状附在管壁上,打开时极易散失,所以打开管子前请先离心10,000rpm,1min,然后再慢慢打开管盖。
6. 在装有引物的eppendorf管内加入100-500μl双蒸水,盖上管盖,充分上下振荡5-10分钟,再次离心10,000rpm,1min。
7. 计算原引物管primer的浓度(必要时测OD260核对厂家提供引物量是否正确)。
8. 计算并将应用primer稀释为10pmol/μl。
9. 标明原引物管、应用引物管、稀释方法,置-20℃保存。