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降落PCR退火温度的设计

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PCR退火温度应如何设置?

降落PCR是在同一个PCR管内进行PCR,只是每个循环的温度不同(如每个循环降1度)。一般兼并引物 用这种方法多些。

设计多循环反应的程序,以使相连循环的退火温度越来越低。由于开始时的退火温度选择为高于估计的Tm值,随着循环的进行,退火温度逐渐降到Tm值,并最终低于这个水平,用于确保第一个引物—模板杂交 事件发生在最互补的反应物之间,即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值,但此时目的扩增产物已开始几何扩增,在剩下的循环中处于超过任何滞后(非特异)PCR产物的地位。

由于目标是在较早的循环中避免低Tm值配对,在TD—PCR 中最好应用热启动技术。设计时,退火温度的范围应跨越15℃左右,从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃。

例:一对没有简并的引物—模板的计算Tm值为62℃。

则:从65℃—>50℃(每2cycles降退火温度1℃),再在50℃退火温度下做15个循环。

实验中如持续出现假象带(杂带),则是因为起始退火温度太低,或目的扩增产物和非目的产物的Tm值相差无几,或非目的扩增物以更高的扩增效率扩增,可把退火温度每降低1℃所需的循环数增加到3或4。

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