pcr退火温度是根据什么原则设计？

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PCR退火温度应如何设置？

在模板变性后温度快速冷却至40℃～60℃(某个退火温度)的时候，可使引物 和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞，这就使PCR后期的过程成为可能。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃为选择最适退火温度的起点较为理想。

另一种说法：熔解温度(Tm)是引物的一个重要参数。这是当50%的引物和互补序列表现为双链DNA 分子时的温度.Tm对于设定PCR退火温度是必需的。在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列有效退火， 同时还要足够高，以减少非特异性结合。合理的退火温度从55℃到70℃。退火温度一般设定比引物的 Tm低5℃。

设定Tm有几种公式。有的是来源于高盐溶液中的杂交 ，适用于小于18碱基的引物。 有的是根据GC含量估算Tm。确定引物Tm最可信的方法是近邻分析法。这种方法从序列一级结构和相邻碱基的特性预测引物的杂交稳定性。大部分计算机程序使用近邻分析法。

Tm值除了用软件之外，还可以这个公式：2(A+T)+4(C+G)，然后减5—10度

根据所使用的公式及引物序列的不同，Tm会差异很大。因为大部分公式提供一个估算的Tm值，所有退火温度只是一个起始点。可以通过分析几个逐步提高退火温度的反应以提高特异性。开始低于估算的Tm5℃，以2℃为增量，逐步提高退火温度。较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。

为获得最佳结果，两个引物应具有近似的Tm值。引物对的Tm差异如果超过5℃，就会引物在循环中使用较低的退火温度而表现出明显的错误起始。如果两个引物Tm不同，将退火温度设定为比最低的Tm低5℃

或者为了提高特异性，可以在根据较高Tm设计的退火温度先进行5个循环，然后在根据较低Tm设计的退火温度进行剩余的循环。这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。

另外，由于PCR仪的不同，注意其退火温度的设定：一般的PCR仪允许设置跨度12-15度的梯度范围，所以你的梯度范围尽可能设置宽一点，争取一轮梯度就可以确定最佳可用退火温度。

具体从多少度到多少度，要看你这对引物的Tm值，如果两个引物Tm值不高，可以设置48-60的梯度;否则可以设置58-70度的梯度;如果两个引物的Tm中等，则可以设置53-65的梯度范围，具体情况灵活掌握。

传统梯度PCR仪中是可以放置12个样品进行梯度的，需要注意的是每个相邻两孔间的温度差异是不等的，尤其是第2、3孔与第1孔接近，第10、11孔与第12孔接近。可以舍弃第2、2、10、11孔，只在第1、4、5、6、7、8、9、12孔中放置共8个样品，孔间温度变化几乎呈真正的梯度状。