教你3分钟使用FastPCR设计简并引物

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一步步教你设计简并引物 PCR实验室产品选择指南

一、从别无选择的蛋白序列设计简并引物 ，如：

M(A/T)ASV(E/D)NR(Q/H/Y)F

你只需要用FastPCR的DNA 、Protein互转功能即可。

1、分析可能的组合，如下(fas TA format)：

>1

MAASVENRQF

>2

MTASVDNRHF

>3

MTASVDNRYF

将以上可能序列粘贴到FastPCR，如下图：

<center> <img alt="教你3分钟使用FastPCR设计简并引物" height="452" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378380433.jpg" width="611" /></center>

2、将蛋白序列转换为DNA序列

<center> <img alt="教你3分钟使用FastPCR设计简并引物" height="83" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378380437.jpg" width="622" /></center>

3、结果显示在result.txt中

<center> <img alt="教你3分钟使用FastPCR设计简并引物" height="542" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378380435.jpg" width="592" /></center>

4、综合各简并序列，将各位置的碱基合并，如下：

>Degenerate DNA

atggcngcntcngtngaraaycgncartty

atgacngcntcngtngayaaycgncaytty

atgacngcntcngtngayaaycgntaytty

综合为：

atgacngcntcngtnganaaycgnyantty

5、计算简并倍数(Degenerate Fold),本例为：

1×1×1×1×1×4×1×1×4×1×1×4×1×1×4×1×1×4×1×1×2×1×1×4×2×1×4×1×1×2=131072

6、适当去除末端碱基，用I代替若干N，减少简并倍数，一般有效简并引物的简并倍数<1000，(当然也有例外)。引物设计完成。如下：

atgacngcntcnIgtIgaIaaycg

最后引物简并倍数为128

二、从若干完全保守区设计简并引物

1、输入保守区蛋白序列

>1 //

MAASVDNRQYARLEPGLNGVVR

>2 //

RKGGALNVCFEGSEDLPGG

>3

MMNNCWFRVKTNVCKPHKGEI

>4

ILLREELDGWAEQYPDRLK

(//表示设计Left primer，表示设计Right primer)

<center> <img alt="教你3分钟使用FastPCR设计简并引物" height="469" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378380434.jpg" width="640" /></center>

2、选择序列为Protein

<center> <img alt="教你3分钟使用FastPCR设计简并引物" height="103" src="http://img.dxycdn.com/trademd/upload/asset/meeting/2013/09/06/A1378380436.jpg" width="649" /></center>

3、改变PCR primer options(同特异引物设计)

4、选择PCR类型，，RUN。(同特异引物设计)

5、选择质量较高的引物，计算简并倍数(同上)

6、用I代替若干N，减少简并倍数。引物设计完成。

三、介于完全保守于不保守蛋白序列间的简并引物设计可参照以上两种引物的设计方法。