CODEHOP方法设计简并引物的经验
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近日看到两位虫友发帖交流有关CODEHOP方法设计简并引物，这让我想起两年前因为需要获得几个家族的未知序列特异基因而学习利用codehop方法设计简并引物的经历。当时，通过常规方法设计出来的简并引物扩增效率极低，而且特异性非常差，为此纠结了好一段时间。
后来从一同事那里得知设计简并引物可以利用codehop方法，但是他对该方法也只是听说没有用过，所以我只能自己在网上查找资料并且试图询问有经验的朋友的帮助。除了找到几篇经典文献，在网上寻求帮助几乎没有什么信息。
也许是因为用过该方法的人比较少，多数帖子只是看到有人在讨论，但是没有使用经验。
通过我的经验，感觉codehop方法设计简并引物的确有它的优点可实用性。今天又看到有人求助，所以索性把自己的经验说一说，让更多需要的朋友能够从中获益。
首先我想说codehop本身是一种简并引物设计 理论方法(COnsensus DEgenerate Hybrid Oligonucleotide Primers )。传统简并引物设计 方法通常简并度过高，导致有效引物利用率低，减小简并引物长度获得小简并度的同时又降低了退火温度 ，不利于扩增。
利用codehop方法设计简并引物与传统方法比较应该具有更高的扩增特异性和灵敏度等优点。
Codehop方法的原理是设计的简并引物包括两个部分，一部分利用序列比对中得到的保守区内连续保守的3-4个氨基酸序列(9-12个碱基)设计得到3’简并核心区;另一部分是根据根据保守氨基酸和密码子偏好性原则预测得到最佳配对的5’非简并夹板区。
设计过程中利用减小3’简并核心区的长度可以减少简并引物中简并碱基的使用量，扩增过程中，5‘非简并夹板区可以很好的稳定3’简并核心区与模板的结合，从而很大程度上提高了扩增的特异性，而且利用加长5’非简并夹板区序列可以提高引物退火温度 同时不增加简并度。
尽管初轮扩增中5‘特异区可能与模板序列发生错配，但是3’核心区的不匹配会使引物在延伸过程中失效，几轮扩增后引物特异性匹配会大幅增加，以此提高特异性和准确率。
藉此理论依据，在利用CODEHOP方法设计简并引物时。
一，利用NCBI 搜索不同物种 中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。由于密码子偏好性差异，不同的核酸序列可能表达出相同的氨基酸序列，而氨基酸序列才具有真正的保守性。在这一过程中，如果目的基因来源于单一物种 ，最好搜索相应的亲缘或同源物种的蛋白序列。
二，将找到的氨基酸序列进行多序列比对，有很多工具软件 可以进行这一工作，个人推荐在线工具ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)。
三，利用多序列比对找到基因保守区后，需要选取合适的区域来设计引物。因为codehop方法要求引物有两个部分，3‘核心区长度应为11-12个碱基，5’夹板区要求18-25个碱基。
也就是说我们应该在基因上下游各找到一个保守区域至少有4个连续保守的氨基酸位点作为3‘核心区，而且在这4个保守位点附近其他7个氨基酸位点应该也具有一定保守度，作为引物的5’夹板区。
四，选取好保守区后，就可以开始着手设计引物。首先针对所选取的氨基酸保守序列，将其翻译成核苷酸 序列，在翻译时参照相应的密码子偏好表找到目的基因的来源物种的密码子偏好。
同时为了更精确，可以把多序列比对中来源于其他亲缘或同源物种的氨基酸序列的核酸编码序列找到，并做比对，以此更加确定引物3‘核心区序列。
当确定了引物的3’核心区后，开始在这个核心区对应的5’端上游序列上利用同样的方法选取氨基酸位点，翻译成核苷酸 序列，不同的是，这个区域翻译过程中遇到不确定的碱基编码可以进行相应简并。
需要注意的是，3‘端设计时结束核苷酸应为编码相应氨基酸的三联密码子的更为保守的第一位或第二位，以在扩增中顺利延伸。另外，5’夹板区也应尽可能减少简并度，以提高扩增特异性。
五，设计结束，检查引物简并度，尽量控制在低范围内。检查引物退火温度，应适当高一些，以便必要时利用touchdown PCR 提高特异性产物量。或根据自己所需对引物进行其他修饰。
以上是根据个人经验总结的CODEHOP简并性引物设计方法。基本方法是这样的，每个人在实际应用中根据自己不同需要可以灵活运用。
另外，有必要说一下的是，CODEHOP引物设计方法有自己在线的引物设计工具：iCODEHOP目前为v1.0版本。
我个人使用经验来看，这个设计工具比较适合初用上手，但是如果对引物有特殊要求或者要求更加适合特定物种基因，最好还是将该在线工具结合人工核对，这样效率更高，准确度更好。
因为这个在线工具比较容易上手，我就不再做介绍了。有问题可以联系我，我明白的尽量解答，不明白的也可以讨论共同进步。
