简并引物设计方法及原则

（1）利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白质或cDNA编码的氨基酸序列

因为密码子的关系，不同的核苷酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTP（通过蛋白查蛋白），在整个NR数据库中查找与之相似的氨基酸序列。

（2）对所有的序列进行多序列比对

将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对， 可选工具有Clustal W/X， 也可在线分析。所有序列的共有部分将会显示出来。 “”表示保守， “：”表示次保守。

（3）确定合适的保守区域

设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域， 且两个保守区域相距50~400个氨基酸残基为宜， 使得PCR产物在150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸的保守区，因为每条引物至少18bp左右。
若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸序列的保守区，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘关系近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对，总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次的结果反复调整。最终目的就是有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。

（4）利用软件设计引物

当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了， 其中Primer 5.0 支持简并引物的设计， 将参与多序列比对的序列中的任一条导入Primer 5.0 中，将其翻译成核苷酸序列，该序列群可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R=A/G，Y=C/T，M=A/C， K=G/T， S=C/G， W=A/C/T， B=C/G/T，V=A/C/G， D=A/G/T， N=A/C/G/T， 该具有简并性的核苷酸链必然包含上一步中找到的氨基酸保守区域的对应部分，在Primer 5.0 中修改参数，令其在两个距离合适的保守的nt区域内寻找引物对，总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。

（5）对引物的修饰 若得到的引物为：

5-NAGSGNGCDTTANCABK-3，则简并度=4×2×4×3×4×3×2=2304， 很明显该条引物的简并度很高不利于PCR， 可以通过次黄嘌呤代替N（因为次黄嘌呤可以很好的和4种碱基配对）和根据物种密码子偏好这两种方法来降低简并度。这样设计出来的简并引物对，适用于比对的氨基酸序列所属物种及与这些物种分类地位相同的其他物种。

从蛋白到核酸， 请注意：

（1） 尽量选择简并度低的氨基酸区域为引物设计区，如蛋氨酸和色氨酸仅有一个密码子。

（2） 充分注意物种对密码子的偏好性，选择该物种使用频率高的密码子，以降低引物的简并性。

（3） 引物不要终止于简并碱基，对大多数氨基酸残基来说，意味着引物的3末端 不要位于密码子的第三位。

（4） 在简并度低的位置，可用次黄嘌呤（dI）代替简并碱基。

以上几点遵循的总的原则为： 尽量降低引物的简并度，尤其在3'末端或近3'末端。